张陆强,王丽雅,樊利春

1.海南医学院儿科学院,海南海口 570206;2.海口市妇幼保健院感染与疾病控制科,海南海口 570000;3.海口市妇幼保健院儿科,海南海口 570000

支气管哮喘是一种慢性呼吸道疾病,在儿童中较常见,近年来受遗传因素及环境污染加重的影响,儿童患病率呈上升趋势,该病主要特征为呼吸道高反应性,是由多种细胞与炎症细胞介质引发[1-2]。支气管哮喘的炎症反应涉及多种活化细胞,其可促进炎症因子水平上升[3-4]。炎症反应引发的不可逆性气道结构与功能变化,可演变为呼吸道结构性改变为气道重塑,引起气道高反应性与气道阻塞,导致患儿出现喘息、胸闷、呼吸困难等症状[5]。尽管目前针对儿童支气管哮喘的诊治已取得较大进展,但整体治疗水平仍欠佳[6]。故寻找与支气管哮喘疾病进展相关的生物标志物以评估患儿病情及指导治疗具有重要价值。相关研究显示,气道炎症是支气管哮喘发生、发展的关键机制,长链非编码核糖核酸(lncRNA)与微小RNA(miRNA)等非编码RNA均参与了气道炎症进展[7]。lncRNA ANRIL是一种新近发现的lncRNA,其已被证实可以调节心血管和炎性疾病中的炎症反应,通过抑制核因子κB信号通路的激活提高气道上皮细胞紧密连接蛋白表达,从而下调lncRNA ANRIL表达,减少细胞分泌炎症因子[8-9]。miR-423-5p作为下游miRNA之一,在人类气道上皮细胞中下调,且过表达miR-423-5p可以通过增强足细胞活力、抑制细胞凋亡和炎症反应来拮抗高糖诱导的足细胞损伤[10]。本研究拟通过分析血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p与支气管哮喘患儿气道炎症、重塑的关系及其预测价值,以期为支气管哮喘防治提供更多参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取海口市妇幼保健院(简称本院)2020年6月至2022年12月收治的支气管哮喘患儿98例作为研究对象,其中女47例,男51例;年龄为5～12岁,平均(8.40±1.42)岁;病程为2～7年,平均(5.52±0.63)年;病情严重程度:轻度47例、中度42例、重度9例。纳入标准:(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中支气管哮喘相关诊断标准[11];(2)无胸廓病变;(3)临床资料完整且家属知情同意;(4)无其他呼吸系统疾病。排除标准:(1)过敏性鼻炎等气道内阻塞性疾病;(2)免疫性疾病、精神性疾病;(3)伴有心、肝、肾等重要脏器严重障碍;(4)先天性气道或肺组织发育异常;(5)近3个月内使用糖皮质激素或有呼吸道感染史。根据文献[11]中的哮喘分期标准将研究对象分为急性发作期患儿46例(发作期组);临床缓解期患儿52例(缓解期组)。发作期组女22例,男24例;病程3～8年,平均(5.61±0.54)年,按病情严重程度分为轻度21例、中度22例、重度3例;年龄为5～11岁,平均(8.61±1.50)岁。缓解期组女25例,男27例;病程3～7年,平均(5.74±0.52)年,按病情严重程度分为轻度26例、中度20例、重度6例;年龄6～12岁,平均(8.22±1.36)岁。另选取同期于本院体检健康的50例儿童作为健康组,其中女19例,男31例;年龄为4～12岁,平均(8.36±1.37)岁。各组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已获本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1血清标本采集 急性发作期患儿入院后给予祛痰给氧、纠正水电解质紊乱等常规治疗。采集支气管哮喘患儿入院后第2天清晨空腹静脉血3 mL,健康组在体检时留血3 mL备用;以3 000 r/min速度离心15 min,离心半径为10 cm,取上层血清置于试管内,放于-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2.2血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p检测 使用Trizol试剂盒(来于张家口赛诺生物科技有限公司)提取血清总RNA,用微量分光光度计[科纳美(上海)科学仪器有限公司,型号F-320]验证其纯度与浓度,使用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA作为模板,按SYBR Premix Ex Taq试剂盒(来自上海赫果生物科技有限公司)行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)扩增,反应条件为:95 ℃反应90 s、95 ℃反应30 s、62 ℃反应30 s、72 ℃反应15 s,共循环40次,收集其循环阈值。lncRNA ANRIL正向引物为5′-TGCTCTATCCGCCAATCAGG-3′,反向引物为5′-GGGCCTCAGTGGCACATACC-3′;miR-423-5p正向引物为5′-GCCCCCAGCGCCCAAC-3′,反向引物为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,内参U6的正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAG AAGATT-3′,反向引物为5′-GGAACGCTTCACG AATTTC-3′。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA ANRIL、miR-423-5p相对表达量。

1.2.3炎症因子检测 采用酶联免疫吸附试验法检测血清白细胞介素(IL)-13、转化生长因子(TGF)-β1、血管内皮生长因子(VEGF)水平,试剂盒购自上海奥威生物科技有限公司,操作严格按说明书进行。

1.2.4气道重塑指标测定 通过高分辨率胸部CT检查,选择主动脉弓、气管分叉上下各1 cm、右肺下静脉和横隔顶上2 cm,于放大后的CT图上用电子标尺测量气道外直径(D)、内直径(L),连续测量3次取其平均值;支气管厚度(T/D)为气道外内外直径差与外直径比值,管壁面积/支气管道总横截面积(WA)为(D2-L2)/D2。

1.2.5肺功能检测 采用肺功能检测仪检测患儿第一秒用力呼气量(FEV1)、最高呼吸气流(PEF)、最大呼气中期流量(MMEF)指标,肺功能检测仪由伟亚安医疗器械(上海)有限公司提供,型号 MasterScreen。

2 结 果

2.1各组血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p相对表达量比较 缓解期组与发作期组血清lncRNA ANRIL相对表达量高于健康组,血清miR-423-5p相对表达量低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05);发作期组血清lncRNA ANRIL相对表达量高于缓解期组,血清miR-423-5p相对表达量低于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p相对表达量比较

2.2各组血清炎症因子指标比较 发作期组与缓解期组血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于健康组,差异有统计学意义(P<0.05);发作期组血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清炎症因子指标比较

2.3各组气道重塑与肺功能指标比较 缓解期组与发作期组T/D、WA高于健康组,FEV1、PEF、MMEF水平低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05);发作期组T/D、WA高于缓解期组,FEV1、PEF、MMEF水平低于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组气道重塑与肺功能指标比较

2.4血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p表达与气道炎症与重塑指标相关性分析 Pearson相关性分析结果显示,血清lncRNA ANRIL表达与炎症因子、气道重塑指标呈正相关,与肺功能指标呈负相关(P<0.05);miR-423-5p表达与炎症因子、气道重塑指标呈负相关,与肺功能指标呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p表达与气道炎症与重塑指标相关性分析

2.5血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p诊断支气管哮喘的预测价值 ROC曲线分析显示,血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p单独及联合检测诊断支气管哮喘的曲线下面积(AUC)及其95%CI分别为0.772(0.569～0.954)、0.707(0.451～0.965)、0.865(0.727～0.977),联合检测诊断支气管哮喘的预测价值较高。见表5和图1。

图1 ROC曲线分析

表5 ROC曲线分析

3 讨 论

支气管哮喘患儿早期表现为短暂性呼吸困难、胸闷咳嗽等症状,若不能及时治疗可发展为急性发作期,表现为症状突然且持续加重,目前支气管哮喘只能通过药物缓解或自行缓解,无法完全治愈[12]。支气管哮喘主要为嗜酸性粒细胞浸润,参与慢性气道炎症病变,该炎症反应增加了气道高反应性[13]。炎症细胞因子在支气管哮喘患儿气道组织中发生浸润、聚集、激活和释放,且各炎症细胞因子在气道重塑中也发挥重要作用[14]。非编码RNA是丰富的RNA分子,翻译蛋白质的能力有限,人体内非编码RNA的失衡与多种人类疾病的病理学有关[15]。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA,不能编码蛋白质,被认为是包括炎症、血管生成和致癌在内的各种生物生理、病理过程的关键参与者[16]。miRNA是一种约22个核苷酸长的非编码RNA小分子,作为信号分子可与信使RNA结合形成复合物,并调节下游信号通路[16]。

有研究显示,lncRNA生长阻滞特异性转录异常对气道平滑肌细胞与气道上皮细胞炎症产生影响,能促进支气管哮喘等慢性气道疾病发生发展[17]。lncRNA ANRIL因其在冠状动脉疾病和尿酸肾病等炎症性疾病中的遗传意义而被熟知,其在肺部疾病发病机制中的作用通过促进非小细胞肺癌疾病进展而得到证明[18]。本研究结果显示,缓解期组与发作期组血清lncRNA ANRIL相对表达量高于健康组,发作期组血清lncRNA ANRIL相对表达量高于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA ANRIL可能通过促进淋巴细胞、嗜酸性粒细胞增长等过程释放炎症介质,由于急性发作期患者体内炎症反应更重,因此lncRNA ANRIL表达上调。miRNA为非编码RNA分子,经靶向结合mRNA抑制转录与转录后的翻译过程,还参与多种病理生理过程,引起mRNA降解,并通过多信号通路参与哮喘等疾病气道重塑过程[19]。本研究结果显示,缓解期组与发作期组血清miR-423-5p相对表达量低于健康组,发作期组血清miR-423-5p相对表达量低于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05)。分析原因可能是miR-423-5p下调可引起缺氧导致心肌细胞凋亡、线粒体功能障碍等,急性期患者炎症、免疫反应紊乱程度更高[20]。

IL-13能单独介导哮喘发生,通过使嗜酸性粒细胞在体内聚集,增加黏液分泌而引起炎症,于气道重塑中发挥作用[21];TGF-β1可降低肺功能、增加气道反应性等,可促进支气管周围胶原沉积并加重病情[22];VEGF在肺组织中广泛分布,属于促内皮细胞有丝分裂剂,对组织纤维化有诱导作用,对平滑肌细胞的基质金属蛋白酶生成具有促进作用,进而增加细胞外基质以促进血管内皮细胞纤维增生[23]。本研究结果显示,发作期组与缓解期组血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于健康组,发作期组血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05),说明炎症因子指标在支气管哮喘发病机制中发挥协同作用,降低以上炎症因子水平能有效缓解患儿病情。本研究结果显示,缓解期组与发作期组T/D、WA高于健康组,FEV1、PEF、MMEF水平低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05);发作期组T/D、WA高于缓解期组,FEV1、PEF、MMEF水平低于缓解期组,差异有统计学意义(P<0.05),说明支气管哮喘患儿存在不同程度气道重塑与肺功能损伤,病情越严重,其气道重塑和肺功能下降也越严重。

Pearson相关性分析结果显示,血清lncRNA ANRIL表达与气道炎症、重塑指标呈正相关,与肺功能指标呈负相关;miR-423-5p表达与气道炎症、重塑指标呈负相关,与肺功能指标呈正相关。提示血清lncRNA ANRIL可能通过上调炎症因子表达以促进支气管哮喘患儿气道重塑并导致肺功能损伤;miR-423-5p是参与调控血管形成、炎症反应等过程的miRNA,对炎症反应具有抑制作用,miR-423-5p表达下调可促进机体炎症形成,加重病情[24]。ROC曲线分析显示,lncRNA ANRIL、miR-423-5p单独及联合检测的AUC分别为0.772、0.707、0.865,其中联合检测的诊断价值较高,说明血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p联合检测诊断支气管哮喘具有较好的预测价值,分析原因为血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p诊断支气管哮喘的预测互为补充,发挥协同作用以提高诊断支气管哮喘的预测效能。

综上所述,支气管哮喘患儿血清lncRNA ANRIL相对表达量上升、miR-423-5p相对表达量下降,与气道肺功能、炎症因子及气道重塑指标密切相关,联合检测诊断支气管哮喘的预测效能较高。