陈丽萍,籍 强,陈艳红,史永兴,冯 平,林卫佳,项保利,赵建清

河北北方学院附属第一医院:1.呼吸与危重症医学科;2.胸心血管外科;3.病案管理科,河北张家口 075000

非小细胞肺癌(NSCLC)占所有原发性支气管肺癌85.00%以上,是肺癌最常见类型,据国际癌症研究机构报道,2020年我国肺癌新发病例815 563例,占全球肺癌新发病例的36.96%,死亡714 699例[1]。因此针对NSCLC患者预后评估是当前研究热点。实验证实,上皮间质转化(EMT)在NSCLC发生、发展中起着重要作用[2]。寻找EMT相关影响因素有利于NSCLC患者预后评估。研究表明,长链非编码核糖核酸(LncRNA)能通过调控EMT等机制参与NSCLC发生、发展[3]。生长抑制特异性基因5(GAS5)是新近发现的一种LncRNA,与乳腺癌EMT和胶质瘤患者预后有关[4-5]。磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸盐磷酸酶(LHPP)是一种组氨酸磷酸酶,能通过调控多种蛋白磷酸化和信号通路参与肿瘤EMT和细胞恶性进展[6]。基于此,本研究拟探讨NSCLC组织中lncRNA GAS5、LHPP表达与EMT相关性及临床意义,旨在为改善NSCLC患者预后提供更多思路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年6月至2020年1月在河北北方学院附属第一医院行手术切除的NSCLC 90例患者的癌组织及距离癌组织大于3 cm的癌旁组织。NSCLC 90例患者中女31例、男59例,年龄25～74岁,平均(60.54±7.65)岁,47例吸烟、53例有淋巴结转移。NSCLC 90例患者病理类型:25例腺癌、54例鳞癌、11例腺鳞癌;肿瘤最大径:≥3 cm者57例、<3 cm者33例;分化程度:33例低分化、57例中高分化;肿瘤TNM分期[7]:46例Ⅰ～Ⅱ期、44例Ⅲ期。纳入标准:(1)NSCLC经病理检查确诊;(2)年龄≥18岁;(3)接受根治性或姑息性切除;排除标准:(1)合并精神疾病;(2)合并其他部位恶性肿瘤;(3)非初诊患者;(4)合并其他肺部疾病;(5)入院前已接受抗肿瘤治疗;(6)合并急慢性感染;(7)不可手术切除或术前接受化疗;(8)合并自身免疫性疾病;(9)不能耐受手术。本研究经医院伦理委员会批准(伦理编号:K2020298),患者或家属签署同意书。

1.2方法 NSCLC患者癌组织和癌旁组织使用总RNA提取试剂盒(广州威佳科技有限公司,货号:R0016)提取总RNA,紫外分光光度计鉴定RNA纯度和完整性合格后[吸光度(A)260/A280为1.8～2.0],通过逆转录酶试剂盒(北京祥生兴业科技有限公司,货号:RR001B)将RNA逆转录为cRNA。按照聚合酶链反应试剂盒(上海翌圣生物科技股份有限公司,货号:10102ES03)说明书,使用实时荧光定量聚合酶链反应系统进行扩增。反应总体积共20 μL,其中cRNA模板1 μL、2×Hieff®PCR Master Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、去离子水7 μL;循环参数:95 ℃预变性5 min 1次,94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 35次,终延伸72 ℃ 10 min。基因引物序列见表1,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参,2-ΔΔCt法计算NSCLC患者癌组织和癌旁组织中lncRNA GAS5、LHPP和EMT相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-Cad)、N-钙黏蛋白(N-Cad)和波形蛋白(VIM)]的相对表达量。

表1 基因引物序列

1.3预后分组 NSCLC患者术后通过电话或门诊方式随访3年(每次3～6个月),统计3年总生存率,随访终止事件为患者死亡或2023年1月。根据NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达均值分为高表达组、低表达组。

2 结 果

2.1NSCLC患者癌组织和癌旁组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA和EMT相关蛋白表达比较 NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA、E-Cad mRNA表达低于癌旁组织,N-Cad mRNA、VIM mRNA表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

注:A为NSCLC组织和癌旁组织中lncRNA GAS5表达比较;B为NSCLC组织和癌旁组织中LHPP mRNA表达比较;C为NSCLC组织和癌旁组织中E-Cad mRNA表达比较;D为NSCLC组织和癌旁组织中N-Cad mRNA表达比较;E为NSCLC组织和癌旁组织中VIM mRNA表达比较。

表2 NSCLC患者癌组织和癌旁组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA和EMT相关蛋白表达比较

2.2NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA与EMT相关蛋白表达的相关性 Pearson相关性分析显示,NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5与E-Cad mRNA表达呈正相关(r=0.724,P<0.001),与N-Cad mRNA、VIM mRNA表达呈负相关(r=-0.699、-0.689,P<0.001);LHPP mRNA与E-Cad mRNA表达呈正相关(r=0.751,P<0.001),与N-Cad mRNA、VIM mRNA表达呈负相关(r=-0.718、-0.731,P<0.001);lncRNA GAS5与LHPP mRNA表达呈正相关(r=0.651,P<0.001)。见图2。

图2 NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA与EMT相关蛋白表达的相关性分析

2.3lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 不同分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移的NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤最大径的NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

2.4lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达与NSCLC患者3年总生存率的关系 随访3年,90例NSCLC患者失访4例,死亡43例,3年总生存率为52.22%(47/90)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,lncRNA GAS5高表达组(lncRNA GAS5≥1.32,44例)的3年总生存率[68.18%(30/44)]高于lncRNA GAS5低表达组(lncRNA GAS5<1.32,46例)的3年总生存率[36.96%(17/46)];LHPP mRNA高表达组(LHPP mRNA≥1.12,46例)的3年总生存率[67.39%(31/46)]高于LHPP mRNA低表达组(LHPP mRNA<1.12,44例)的3年总生存率[36.36%(16/44)],差异有统计学意义(χ2=10.274、10.322,P<0.05)。见图3。

图3 不同lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达的NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲线

2.5NSCLC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析 将3例失访患者排除,以性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤最大径、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移、lncRNA GAS5、LHPP mRNA为自变量,随访时间为时间变量,生存状态(死亡/存活=1/0)为因变量,建立NSCLC患者预后的Cox回归模型。结果显示:低分化、肿瘤TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移为NSCLC患者死亡的独立危险因素,lncRNA GAS5≥1.32、LHPP mRNA≥1.12为独立保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 NSCLC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

3 讨 论

NSCLC是全球癌症相关死亡的主要原因,随着我国居民健康素养水平的稳步提升和低剂量螺旋CT筛查的开展,我国NSCLC高危人群筛查、管理和早期诊断取得较大进展,但仍有75%的患者在初次诊断时处于晚期阶段[8-11]。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为间质表型细胞的过程,为胚胎正常发育所必需的过程,但在NSCLC细胞中EMT异常激活会增强其侵袭和转移能力,促进NSCLC细胞向周围或其他组织侵袭、转移,以促进NSCLC细胞增殖、侵袭、转移、存活和耐药等恶性进展[12]。研究NSCLC患者EMT和预后相关影响因素,对指导其个体化治疗和预后评估具有重要的意义。

E-Cad和N-Cad作为上皮细胞间连接的重要蛋白,前者能抑制上皮细胞运动性抑制其向间质表型转化,以保持上皮细胞结构稳态而抑制EMT,后者能促进细胞-细胞间黏附进而促进EMT;VIM作为中间丝蛋白能增强细胞强度、韧性、弹性、拉伸性促进EMT[13]。本研究结果显示,NSCLC患者癌组织中E-Cad mRNA表达降低,N-Cad mRNA、VIM mRNA表达升高,说明NSCLC存在明显的EMT,符合其进展机制。NSCLC是多种因素参与的复杂过程,表观遗传改变通过影响多种机制参与NSCLC过程[14]。LncRNA是一类新兴表观遗传改变调控分子,能通过海绵吸附微小RNA,竞争性干扰其与mRNA结合或直接与蛋白质相互作用参与NSCLC进程[3]。lncRNA GAS5是位于人染色体1q25.1上的一种lncRNA,最初研究发现lncRNA GAS5过表达时能诱导T细胞周期阻滞和凋亡,而低表达时能促进T细胞周期进展和生长,近年有研究发现lncRNA GAS5也对其他多种细胞具有生长抑制作用[15]。有研究报道,lncRNA GAS5能靶向miR-26a抑制蛋白酪氨酸激酶1/信号转导和转录活化因子3信号通路抑制子宫内膜样癌细胞侵袭和凋亡;lncRNA GAS5能靶向miR-424抑制宫颈癌增殖[16-17]。这些研究提示,lncRNA GAS5在恶性肿瘤中发挥抑制作用。有研究报道,lncRNA GAS5低表达与卵巢癌预后不良有关[18]。有研究指出,lncRNA GAS5低表达与NSCLC细胞周期进展和生长有关[19]。本研究结果显示,NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5表达低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),不同分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移的NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5表达比较差异有统计学意义(P<0.05),lncRNA GAS5≥1.32为独立保护因素(P<0.05),进一步说明lncRNA GAS5参与NSCLC发生、发展。分析原因可能是lncRNA GAS5高表达能靶向miR-205上调磷酸酶和张力蛋白同系物,抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路激活,进而抑制NSCLC细胞增殖、分化、迁移、侵袭和存活,进而提高患者预后[20]。

组氨酸磷酸酶是一类具有磷酸化或去磷酸化的酶,其异常障碍可导致细胞信号传导通路和蛋白表达异常,与肿瘤发生发展密切相关[21]。LHPP是新近被证实的一种组氨酸磷酸酶,位于人染色体10q26.13处,能与组氨酸磷酸酶共同发挥磷酸化和去磷酸化作用,LHPP缺失将导致磷酸化与去磷酸化失衡,进而激活Wnt/β-连环蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号通路,促进肿瘤发生发展[22]。已有研究报道,LHPP低表达与肝癌、脑胶质瘤、肾癌、前列腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤进展有关,提示LHPP是种抑癌基因[22]。有研究报道,LHPP低表达与胃癌、鼻咽癌患者预后不良有关[23-24]。有研究指出,LHPP低表达与NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭有关[25]。本研究结果显示,NSCLC患者癌组织中LHPP mRNA表达低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),LHPP mRNA高表达组的3年总生存率高于LHPP mRNA低表达组的3年总生存率,LHPP mRNA≥1.12为独立保护因素(P<0.05),进一步也说明LHPP参与NSCLC发生、发展。分析原因可能是LHPP高表达能抑制Wnt/β-连环蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号通路激活,抑制NSCLC细胞增殖、分化、迁移、侵袭和促进凋亡,进而促进患者预后改善[22]。

有研究报道,lncRNA GAS5与乳腺癌细胞EMT有关,LHPP与肝细胞癌细胞EMT有关[26-27]。本研究结果显示,NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5与E-Cad mRNA表达呈正相关(r=0.724,P<0.001),与N-Cad mRNA、VIM mRNA表达呈负相关(r=-0.699、-0.689,P<0.001),提示lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达升高可能通过EMT促进NSCLC细胞恶性进展。有研究报道,上调lncRNA GAS5、LHPP能通过抑制EMT以抑制NSCLC细胞恶性进展[19,25]。此外本研究结果显示,lncRNA GAS5与LHPP mRNA表达呈正相关(r=0.651,P<0.001),提示lncRNA GAS5和LHPP可能共同通过EMT参与NSCLC发生、发展。最近YANG等[25]通过双荧光素酶报告基因检测也发现,上调lncRNA GAS5能靶向miR-217上调LHPP表达,进而抑制NSCLC细胞EMT、迁移和侵袭。但本研究结果还需多中心研究验证,关于lncRNA GAS5、LHPP参与NSCLC的机制也有待进一步实验发现。

综上所述,NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA低表达,与EMT相关蛋白表达、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移和预后有关,可能成为NSCLC诊治的新靶点。