王 江,李 艳,贺泓霓,伍 燕

南充市中心医院/川北医学院第二临床医学院妇科,四川南充 637000

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,全球每年子宫内膜癌新发病例达32万人,死亡例数达7.6万人[1]。子宫内膜癌的治疗包括手术治疗、放化疗等,但仍有15%～20%治疗后出现肿瘤复发和转移,复发后5年生存率低于20%[2]。微小核糖核酸(miRNA)参与细胞增殖分化、代谢、衰老及血管生成等过程[3]。miRNA的表达异常与恶性肿瘤的发生发展密切相关,是潜在的肿瘤标志物[4]。miR-141-3p是一种具有肿瘤促进作用的miRNA,研究表明,直肠癌中miR-141-3p的表达上调能够通过抑制抑癌基因B淋巴细胞瘤-2的表达,促进肿瘤细胞的增殖,并抑制肿瘤细胞凋亡[5]。miR-149-3p也是近年来发现的具有肿瘤促进作用的新的miRNA,研究发现,卵巢癌中miR-149-3p表达上调能够通过靶向抑制基质金属蛋白酶组织抑制剂-2,促进肿瘤细胞上皮间质转化,导致肿瘤侵袭和转移能力增强[6]。细胞获得无限增殖潜能是恶性肿瘤的基本特征,子宫内膜癌的发生、发展中涉及增殖基因[增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)]mRNA的过度表达[7-8]。本研究通过检测子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p、miR-149-3p表达,分析其与增殖基因、临床病理特征和预后的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年2月至2019年2月本院诊治的98例子宫内膜癌患者作为研究对象,年龄34～79岁,平均(62.54±6.71)岁。研究对象按照国际妇产科联盟(FIGO)分期标准[9]分为Ⅰ～Ⅱ期61例,Ⅲ期37例;肿瘤分化程度:高分化27例,中分化30例,低分化41例;绝经史:有绝经史64例、无绝经史34例;有无淋巴结转移:无淋巴结转移76例、有淋巴结转移22例。纳入标准:(1)经术后组织病理学检查明确为子宫内膜癌;(2)初次诊治;(3)患者能够配合相关检查治疗及随访。排除标准:(1)近3个月接受激素或化疗治疗;(2)合并其他恶性肿瘤;(3)合并类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病;(4)临床病理及随访资料不完整。本研究经本院医学伦理委员会批准通过,患者或家属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测癌组织和癌旁组织miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表达 留取术中获取的子宫内膜癌患者癌组织和癌旁组织(距离癌组织2 cm),液氮研磨后离心取上清,采用Trizol法提取组织中总RNA,微量分光光度计(美国赛默飞公司,型号Narodrop 1000)检测组织总RNA纯度,A260/A280比值=1.8～2.1。将总RNA逆转录为cDNA,然后进行实时荧光定量PCR。一步法逆转录试剂盒和2×SYBR Green PCR Master mix试剂盒购自北京索莱宝公司,货号T2240,SR1110。总体系10.0 μL,包括2×SYBR Green 5.0 μL,cDNA 1.0 μL,正反向引物各0.5 μL,双蒸水3.0 μL。实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司,型号ABI 7500。miR-141-3p、miR-149-3p反应条件:95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,变性退火延伸共40次循环。PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,变性退火延伸共40次循环。miR-141-3p、miR-149-3p以U6为内参,PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,根据2-△△Ct法计算miR-141-3p、miR-149-3p、PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2随访 所有患者以电话和门诊复查为主进行随访,随访内容为生存情况,随访截止至2022年3月1日。随访终点为随访时间结束或患者死亡。记录患者生存时间,计算3年总体生存率,即自病理确诊日至患者死亡日或随访结束。

2 结 果

2.1子宫内膜癌患者癌组织和癌旁组织中miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表达比较 子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p、miR-149-3p、PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA相对表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 子宫内膜癌患者癌组织和癌旁组织中miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表达比较

2.2子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p、miR-149-3p表达与增殖基因的相关性 子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p、miR-149-3p表达与PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表达呈正相关(均P<0.05)。见表3。

表3 miR-141-3p、miR-149-3p表达与增殖基因的相关性

2.3不同临床病理特征的子宫内膜癌患者癌组织miR-141-3p、miR-149-3p表达比较 FIGO分期Ⅲ期、有淋巴结转移的子宫内膜癌患者癌组织miR-141-3p、miR-149-3p相对表达水平分别高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、肿瘤分化程度、绝经史的子宫内膜癌患者血清miR-141-3p、miR-149-3p相对表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 miR-141-3p、miR-149-3p表达与临床病理特征的关系

2.4miR-141-3p、miR-149-3p表达与子宫内膜癌临床预后的关系 根据miR-141-3p、miR-149-3p相对表达水平的中位数2.10,2.03为临界值,分别分为miR-141-3p高表达组(n=48)和miR-141-3p低表达组(n=50),miR-149-3p高表达组(n=47)和miR-149-3p低表达组(n=51)。子宫内膜癌患者随访过程中,无失访,死亡15例,3年总体生存率为84.69%(83/98)。miR-141-3p高表达组和miR-141-3p低表达组患者3年总体生存率分别为75.00%(36/48)、94.00%(47/50)。miR-141-3p高表达组3年总体生存率显著低于miR-141-3p低表达组,差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.043,P=0.008)。miR-149-3p高表达组和miR-149-3p低表达组患者3年总体生存率分别为74.47%(35/47)、94.12%(48/51),miR-149-3p高表达组患者3年总体生存率显著低于miR-149-3p低表达组,差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.094,P=0.007)。见图1。

图1 Kaplan-Meier曲线分析miR-141-3p、miR-149-3p对子宫内膜癌患者预后的影响

2.5影响子宫内膜癌患者预后的因素分析 以子宫内膜癌患者预后为因变量(1=死亡,0=存活,t=生存时间),以年龄(>60岁vs.≤60岁)、绝经史(有vs.无)、肿瘤分化程度(低分化vs.高中分化)、FIGO分期(Ⅲ期vs.Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴结转移(有vs.无)、miR-141-3p、miR-149-3p为自变量,进行单因素Cox回归分析,将单因素分析中差异有统计学意义的因素(P<0.05)纳入多因素Cox回归分析,结果FIGO分期Ⅲ期、有淋巴结转移、miR-141-3p升高、miR-149-3p升高是影响子宫内膜癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表5、6。

表5 单因素Cox回归分析影响子宫内膜癌患者预后的因素

表6 多因素Cox回归分析影响子宫内膜癌患者预后的因素

3 讨 论

子宫内膜癌是我国女性常见的恶性肿瘤,目前子宫内膜癌的治疗以手术、放化疗等治疗为主,早期患者临床预后较好,但对于晚期或复发患者,远期生存预后较差[10]。子宫内膜癌的疾病机制尚不清楚,其发生与雌激素暴露、代谢异常及遗传易感性等因素有关[11-12]。因此,深入研究子宫内膜癌的病因及机制,寻找影响子宫内膜癌进展及预后的标志物,对子宫内膜癌的临床诊治及改善患者生存预后,具有重要意义。

子宫内膜癌中增殖基因表达异常涉及原癌基因过度激活、转录后调控异常等多种机制[13-14]。miR-141-3p基因位于12p13.31,其能够通过靶向结合靶基因mRNA的3′非编码区,参与细胞分化发育过程,影响炎症、感染等病理生理学过程[15]。LI等[16]研究发现,宫颈癌中miR-141-3p能够在转录后水平诱导趋化因子插头框A2的表达,促进肿瘤上皮间质转化,导致肿瘤侵袭和转移。本研究子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p表达上调,且其表达与FIGO分期及淋巴结转移有关,提示miR-141-3p促进子宫内膜癌的恶性进展。miR-141-3p表达上调的机制可能与长链非编码RNA调控有关。有研究发现,长链非编码RNA母系表达基因3(MEG3)能够作为分子海绵结合并抑制miR-141-3p的表达及功能,乳腺癌中MEG3表达下调导致miR-141-3p升高,其通过抑制RNA结合模体单链作用蛋白3的表达,发挥促进肿瘤过度增殖和凋亡抑制的生物学作用[17]。既往研究表明,子宫内膜癌中存在MEG3表达下调的现象,其可能通过相似的机制,上调miR-141-3p的表达,促进子宫内膜癌的增殖、侵袭和转移[18]。因此,子宫内膜癌中miR-141-3p可能作为一种促癌因子,参与促进子宫内膜癌的发生、发展。本研究中,miR-141-3p的表达与增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表达呈正相关,提示miR-141-3p可能通过促进增殖基因的表达,促进子宫内膜癌的进展,分析其机制,miR-141-3p能够与负调控增殖基因mRNA的3′非编码区互补结合,促进mRNA的切割或翻译抑制,降低mRNA的稳定性,进行促进细胞周期的进行。LI等[19]发现,在鼻咽癌中miR-141-3p的表达上调通过抑制肿瘤转移抑制因子1的表达,促进蛋白激酶B的磷酸化激活,促进鼻咽癌的侵袭和转移。BARDECK等[20]报道,miR-141-3p的表达上调能够激活丝裂原活化的蛋白激酶途径和细胞外信号调节激酶通路,促进下游细胞周期相关基因如CDK4等基因的表达,导致肿瘤细胞过度增殖。本研究结果显示,miR-141-3p升高是影响子宫内膜癌患者预后的独立危险因素,分析其原因,miR-141-3p升高的子宫内膜癌患者肿瘤恶性程度较高,肿瘤侵袭和转移能力较强,导致子宫内膜癌患者预后不良[21]。有研究发现,前列腺癌中miR-141-3p的表达上调能够通过抑制转录因子kruppel样因子-9,促进癌细胞的干性的维持,增强肿瘤对化疗的耐药性,降低化疗疗效,导致患者不良预后[22]。因此,以miR-141-3p为靶点的治疗方案可能有利于改善子宫内膜癌患者的临床预后。

miR-149-3p基因位于人类染色体2q37.3,其作为一种短的调控RNA分子,在转录后水平调控下游基因如活化T细胞核因子4等的表达,与炎症、免疫状态等密切相关[23]。研究发现,卵巢癌中miR-149-3p能够通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A的表达,促进肿瘤细胞由G1期向S期转换,导致肿瘤细胞过度增殖[6]。本研究中,子宫内膜癌患者癌组织中miR-149-3p升高,且与肿瘤FIGO分期及淋巴结转移有关,提示miR-149-3p参与子宫内膜癌的发生、发展。miR-149-3p表达受到复杂的非编码RNA调控网络调节,有学者发现,长链非编码RNA ARAP1反义RNA 1(ARAP1-AS1)能够作为分子支架,结合并抑制miR-149-3p的表达,但在宫颈癌中,ARAP1-AS1表达下调导致miR-149-3p升高,激活糖代谢过程中丙酮酸脱氢酶激酶2的表达,促进肿瘤细胞恶性增殖[24]。本研究中,miR-149-3p的表达与增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表达呈正相关,提示子宫内膜癌中miR-149-3p升高能通过促进增殖基因的表达,促进子宫内膜癌的进展。有学者发现,前列腺癌中miR-149-3p升高可结合残疾基因同源物2相互作用蛋白mRNA的3′非编码区,抑制其蛋白表达,激活核因子-κB信号通路,促进了促炎细胞因子和促血管生成因子如血管内皮生长因子的表达,增强癌细胞的侵袭和转移能力,导致前列腺癌的发生、发展[25]。本研究显示,miR-149-3p升高是影响子宫内膜癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),分析其原因,miR-149-3p作为一种肿瘤促进因子,其可通过促进肿瘤的恶性增殖及转移,促进肿瘤的恶性进展,导致患者预后不佳[26]。

综上所述,子宫内膜癌中miR-141-3p、miR-149-3p的表达与增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表达呈正相关,二者可能通过激活增殖基因的表达,促进子宫内膜癌的发生、发展。miR-141-3p升高、miR-149-3p升高是影响子宫内膜癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。检测子宫内膜癌患者癌组织中miR-141-3p、miR-149-3p表达有助于评估其生存预后。本研究尚也有不足之处,本研究样本量有限,并且miR-141-3p、miR-149-3p在调控增殖基因表达的机制尚不清楚,有待今后进行深入基础实验研究。