吴逸如,白 雨,张启东,刘文虎

(首都医科大学附属北京友谊医院 肾内科, 北京 100050)

随着人口老龄化及糖尿病、高血压发病率的增加,慢性肾脏病(CKD)的患病率不断上升[1]。当CKD进展至终末期肾脏病(ESRD)阶段,患者的生存必须依赖肾脏替代治疗[2],给患者的家庭和社会带来巨大的负担。如何延缓CKD进展至ESRD是目前肾病领域关注的热点问题。肾脏纤维化是所有CKD进展至ESRD的共同病理生理机制[3],延缓肾脏纤维化对于延缓CKD的进展至关重要,然而,目前临床上无有效的抗肾脏纤维化药物[4]。最近的研究表明,许多分子在肾脏纤维化的发生发展中发挥着重要作用,其中糖原合成酶激酶(GSK-3β)是一个不可忽视的治疗靶点。

GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在各种器官组织的纤维化中发挥重要作用,包括心脏、肺、肝脏和肾脏等[5]。然而目前关于GSK-3β与纤维化的研究结果并不完全一致[5]。本课题组前期研究证实了Renalase可以通过抑制ERK通路和氧化应激等机制来减轻肾脏纤维化[6-7]。目前尚不清楚GSK-3β是否参与了这一过程。本研究拟探讨GSK-3β在Renalase抗纤维化过程中的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型

1.1.1 小鼠的选择和喂养 5周龄雄性C57BL/6小鼠,体重16～18 g,购于中国医学科学院实验动物研究所。饲养环境为温度(22 ± 1)°C, 相对湿度(55 ± 5)%的SPF级动物实验室,自由进食水。所有动物喂养2周后进行手术处理。所有实验动物和实验动物安乐死的执行,均取得首都医科大学附属北京友谊医院实验动物管理委员会的许可,并且完全符合《实验动物管理和使用指南》的要求,所有实验动物的饲养均符合SPF及实验动物饲养要求。

1.1.2 单侧输尿管结扎模型的建立 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。单侧输尿管结扎(UUO)组于左侧肾脏近肾门处结扎输尿管,再于输尿管远离肾门处做二次结扎。假手术(Sham)组只游离左侧输尿管而不结扎,然后关闭腹腔。

1.1.3 模型小鼠的给药 购买的小鼠饲养2周后,随机分为下列8组,每组5只并给予相应处理,2周后将小鼠处死用于后续实验。具体分组及处理如下：(1)Sham+Ad-β-gal组：小鼠给予假手术处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU对照腺病毒;(2)Sham+ Ad-Renalase组：小鼠给予假手术处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(3)UUO+ Ad-b-gal组：小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU对照腺病毒;(4)UUO+Ad-Renalase组：小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(5)UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β组：本组小鼠手术前10 d通过尾静脉注射1.0×1012PFU过表达GSK-3β腺相关病毒;小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒;(6)UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi组：小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒及1.0×1010PFU Ad-GSK-3β-RNAi腺病毒;(7)UUO+Ad-Renalase+TM组：小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时分别于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒,于腹腔注射1mg/kg的TM;(8)UUO+Ad-Renalase+4-PBA组：小鼠给予单侧输尿管结扎处理,并于手术时分别于左侧肾静脉注射1.0×1010PFU Renalase腺病毒,于腹腔注射300 mg/kg的4-PBA。以上所用腺病毒及腺相关病毒均购于上海吉凯基因有限公司。

1.2 实验技术

1.2.1 肾脏纤维化的评估 将小鼠用乙醚麻醉后处死,取出手术侧肾脏,固定、包埋、切片后用于实验。应用Masson染色和天狼星红染色评估肾脏纤维化程度。具体操作过程同标准实验方案。染色切片使用配备数码相机的显微镜进行观察。

1.2.2 免疫组化染色 切片脱蜡至水,经H2O2孵育、抗原修复、封闭后加入相应一抗孵育过夜,冲洗孵育二抗,然后DAB显色苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片,显微镜观察。免疫组织化学定量使用Image-Pro Plus软件。光密度(IOD) =密度(平均)×面积;密度是反应阳性蛋白的浓度或强度。平均密度(MOD) = IOD/(SUM×面积)。

1.2.3 Westernblot 检测 取手术侧肾脏,液氮内研磨,加入冰预冷的裂解液摇匀冰浴30 min,4 ℃ 12 000 r/min下离心30 min,取上清液,BCA法测定蛋白含量;加上样缓冲液,95 ℃水浴5 min使蛋白变性,-80 ℃保存,备用做各目的蛋白的测定。具体操作方案同参考文献[6]。

1.2.4 实时荧光定量PCR 将小鼠处死后取手术侧肾脏,在液氮内研磨,参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒说明书,提取总RNA,再行逆转录及扩增。具体测定同参考文献[6]。引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1 GSK-3β在Renalase抗纤维化过程的作用 首先,构建单侧输尿管结扎(UUO)致肾脏纤维化模型并应用腺病毒过表达Renalase观察GSK-3β的变化以探索GSK-3β的可能作用。结果显示,与Sham组相比,UUO组纤维组织增多,而与UUO+Ad-β-gal组相比,UUO+Ad-Renalase组肾脏纤维组织沉积明显减少(图1A);纤维化标志物胶原纤维Ⅰ(Col-Ⅰ)和纤连蛋白(FN)表达明显减少(图1B、C),以上均证明Renalase可以减轻UUO所致肾脏纤维化,这与之前研究结果一致[6]。其次,检测了GSK-3β的表达,结果提示,Sham+Ad-β-gal及Sham+Ad-Renalase组GSK-3β的表达无明显差异,提示上调Renalase本身并不影响GSK-3β的表达;而同时与Sham+Ad-β-gal相比,UUO+Ad-β-gal组GSK-3β蛋白及mRNA表达均明显增加(图1D、E);与UUO+Ad-β-gal组相比,UUO+Ad-Renalase组GSK-3β表达明显下降(图1D、E),提示GSK-3β可能参与Renalase抗肾脏纤维化的过程。

A： Masson染色及天狼星红染色提示Renalase可以改善肾脏纤维化,在Masson三色染色中,蓝色代表纤维组织,在天狼星红染色中,红色代表纤维组织,放大倍数100倍;B、C：免疫组织化学和WB显示UUO后纤连蛋白和胶原Ⅰ的表达增加,放大倍数100倍,棕色或黄色代表染色阳性;D、E：WB和RT-PCR显示,UUO小鼠中GSK-3β表达增加,过表达Renalase后升高的GSK-3β明显回落;*：与Sham+Ad-β-gal组比较,P<0.05;#：与UUO+Ad-β-gal组比较,P<0.05。图1 Renalase在UUO小鼠中的作用及其对GSK-3β表达的影响

为了进一步阐明GSK-3β在Renalase抗肾脏纤维化过程中的作用,分别上调和下调GSK-3β观察Renalase抗肾脏纤维化作用的变化。结果显示,与UUO+Ad-Renalase组相比,UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β组GSK-3β表达明显增加;UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi组GSK-3β表达明显下降(图2A、B),提示上调和下调GSK-3β成功。与UUO+Ad-Renalase组相比,UUO+Ad-Renalase+AAV-GSK-3β组肾间质纤维成分增加(图2C),Col、FN表达明显增多(图2D、E),提示Renalase抗肾脏纤维化的作用几乎被逆转。同时与UUO+Ad-β-gal组相比,UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi组肾脏纤维化明显减轻(图2C),Col-Ⅰ、FN表达下降(图2D、E),说明抑制GSK-3β减轻了UUO小鼠的纤维化;但与UUO+Ad-Renalase组相比,UUO+Ad-Renalase+Ad-GSK-3β-RNAi组肾脏纤维化无明显变化(图2C),Col-Ⅰ、FN表达稍下降,但差异无统计学意义(图2D、E),说明与UUO+Ad-Renalase组相比,下调GSK-3β并不能进一步改善肾脏纤维化,进一步提示Renalase抗纤维化作用是通过抑制GSK-3β实现的,即Renalase通过抑制GSK-3β表达延缓肾脏纤维化进展。

2.2 Renalase调控GSK-3β表达的可能机制 进一步探索了Renalase调控GSK-3β表达的机制。既往有研究显示内质网应激可以调控GSK-3β的表达,那么Renalase是否可以通过调控内质网应激进而抑制GSK-3β最终延缓肾脏纤维化,目前尚不清楚。首先观察了内质网应激在Renalase抗肾脏纤维化中的作用,发现与Sham+Ad-Renalase组及Sham+Ad-β-gal组相比,UUO+Ad-β-gal组小鼠内质网应激被明显激活,表现为内质网应激标志物CHOP、PERK、ATF-4蛋白及mRNA水平表达显著增加,而与UUO+Ad-β-gal组相比,UUO+Ad-Renalase组纤维化标志物Col、FN表达降低的同时激活的内质网应激也被明显抑制,内质网应激标志物蛋白及基因水平明显下降,提示内质网应激参与肾脏纤维化的发生发展,而Renalase可以抑制内质网应激。

通过改变内质网应激状态探索内质网应激是否参与Renalase抗肾脏纤维化过程中对GSK-3β的调控。衣霉素(tunicamycin,TM)是一种内质网应激激动剂,可以通过抑制蛋白质N-糖基化来诱导内质网应激;4-苯基丁酸钠(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是一种内质网应激抑制剂,通过阻断未折叠蛋白反应的激活抑制内质网应激。与UUO+Ad-Renalase组相比,UUO+Ad-Renalase+TM组小鼠肾脏纤维化明显加重,Col、FN显著升高,同时观察到GSK-3β表达明显回升。与UUO+Ad-Renalase组相比,UUO+Ad-Renalase+4-PBA组小鼠纤维化没有进一步改善,同时GSK-3β表达也没有进一步被抑制(图3A～ C),提示Renalase是通过抑制内质网应激改善肾脏纤维化,且内质网应激参与Renalase抗肾脏纤维化及调控GSK-3β表达的作用。

A：Masson染色和天狼星红染色提示,与UUO+Ad-Renalase组相比,当应用TM激活内质网应激后UUO+Ad-Renalase+TM组纤维化明显加重,而应用4-PBA抑制内质网应激后UUO+Ad-Renalase+4-PBA组纤维化没有进一步减轻;在Masson三色染色中,蓝色代表纤维组织。在天狼星红染色中,红色代表纤维组织,放大倍数400倍;B、C：WB和RT-PCR显示,与UUO+Ad-Renalase组相比,当内质网应激被激活时,UUO+AdRenalase+TM组的Col-Ⅰ、FN、GSK-3β的表达增加;当内质网应激被抑制时,UUO+Ad-Renalase+4-PBA组CoL-Ⅰ、FN、GSK-3β的表达没有受到进一步抑制;*：与Sham+Ad-β-gal组比较,P<0.05;#：与UUO+Ad-Renalase比较,P<0.05。图3 内质网应激在Renalase抗肾纤维化中的作用及其对GSK-3β表达的影响

2.3 GSK-3β与内质网应激在Renalase抗肾脏纤维化中的调控关系 进一步探索在Renalase抗肾脏纤维化过程中内质网应激及GSK-3β的调控关系。如上所述,当上调GSK-3β表达后,Renalase抗肾脏纤维化的作用几乎被逆转,但无论上调或下调GSK-3β,内质网应激较UUO+Ad-Renalase组均无明显变化(图4A、B),即在Renalase抗UUO所致肾脏纤维化过程中,GSK-3β表达的改变不影响内质网应激状态。

A、B：WB及RT-PCR显示,不论过表达或敲低GSK-3β表达,与UUO+Ad-Renalase相比内质网应激表达均无明显改变;*：与Sham+Ad-β-gal组比较,P<0.05;#：与UUO+Ad-Renalase比较,P<0.05。图4 GSK-3β对Renalase抗纤维化过程中内质网应激的影响

结合上述实验结果,即在Renalase抗纤维化过程中,激活内质网应激使得GSK/3β表达增加,而上调或下调GSK-3β均不影响内质网应激的状态,说明Renalase是通过抑制内质网应激调控GSK-3β表达进而延缓肾脏纤维化。

3 讨论

肾脏纤维化是慢性肾脏病(CKD)进展至终末期肾脏病(ESRD)的共同通路[8]。前期研究证实Renalase可以延缓肾脏纤维化的发生发展[6- 7]。本研究进一步探索Renalase抗肾脏纤维化的机制。鉴于GSK-3β在纤维化发生发展中的作用,探讨GSK-3β在Renalase抗肾脏纤维化中的作用及可能的机制。UUO术后,随着肾脏纤维化的进展,GSK-3β表达明显上调;而当过表达Renalase后,肾脏纤维化减轻的同时GSK-3β也明显下调。当上调GSK-3β后,Renalase拮抗肾纤维化的作用被抵消;提示Renalase通过抑制GSK-3β改善肾脏纤维化。既往研究显示内质网应激可以调控GSK-3β的表达[9],进一步探讨了内质网应激在Renalase调控GSK-3β的作用。发现UUO术后内质网应激被激活,而过表达Renalase后肾脏纤维化减轻的同时激活的内质网应激被抑制,应用TM激活内质网应激后,Renalase抗纤维化作用被减轻的同时上调的GSK-3β亦被明显抑制,而不论上调或下调GSK-3β,内质网应激均无明显变化。以上结果提示Renalase通过抑制内质网应激下调GSK-3β从而延缓肾脏纤维化进展。

目前GSK-3β在器官纤维化中的研究结果并不一致。在肝脏、肺及心脏纤维化方面,一方面研究认为激活GSK-3β可以改善纤维化[10-17],另一方面有学者证实抑制GSK-3β可以改善器官纤维化[11-12, 14-16, 18]。同样的,目前GSK-3β在肾脏纤维化方面的研究也存在争议。一部分研究认为GSK-3β的激活可以改善肾脏纤维化,比如研究发现在UUO模型中,fingolimod可以通过激活GSK-3β抑制肌成纤维细胞生成及细胞外基质合成减轻肾脏纤维化[19];敲除AKT[20]或SGK1[21]可以通过增加GSK-3β活性抑制UUO所致肾纤维化;锂[22]、血管紧张素Ⅱ[23]及高循环卵泡刺激素(FSH)[24]可以通过抑制GSK-3β促进肾脏纤维化。另一部分研究认为抑制GSK-3β可以减轻肾脏纤维化。在小鼠肾脏缺血在灌注模型中,抑制GSK-3β可以减少肌成纤维细胞数量减轻肾脏纤维化[25-26],体外实验发现TGF-β1可以促进肾成纤维细胞中GSK-3β的表达,抑制GSK-3β可以减轻TGF-β1诱导的纤维化[25]。在糖尿病肾病大鼠模型中,LM49可以通过抑制GSK-3β的活性减少细胞外基质沉积减轻肾脏纤维化[27]。在叶酸所致AKI小鼠模型中,通过抑制GSK-3β的表达和活性,可以减少肾脏纤维化发生,抑制AKI向CKD发展[28-29]。本研究在动物模型中证实,肾脏纤维化时GSK-3β表达明显增加;当过表达Renalase后,纤维化减轻且GSK-3β表达减少,而上调GSK-3β表达后Renalase抗纤维化作用被抵消,提示Renalase通过抑制GSK-3β抑制肾脏纤维化。这与之前的研究结果也并不完全一致,然而,肾脏纤维的发生是诸多促纤维化因子与抗纤维化因子相互作用的动态结果,究竟GSK-3β在肾脏纤维化中发挥怎样的作用仍待进一步研究探讨。

当然,本研究也有一定的局限性。首先,本研究发现Renalase通过抑制内质网应激下调GSK-3β进而拮抗纤维化,而前期研究发现Renalase可以调控ERK的表达[6],且既往研究证实GSK-3β可以调控ERK促进纤维化的发生[5];那么GSK-3β是否参与Renalase对ERK的调控仍待进一步研究探讨。其次,TGF-β/Smad信号通路在纤维化发生发展中意义重大[3],已证实GSK-3β参与TGF-β/Smad的调控[5],本研究发现Renalase通过抑制GSK-3β减轻纤维化进展,但前期研究发现Renalase抗纤维化过程中Smad的表达并无明显变化,也就是说尽管Renalase抑制了GSK-3β但并没有出现Smad的改变,为什么会出现此现象,是否有其他信号通路参与其中仍待进一步研究。最后,如上所述,肾脏纤维化的病因多种多样[3],单侧输尿管结扎所致肾纤维化模型并不能代表所有纤维化发生的病理生理过程,在其他所致肾纤维化疾病中GSK-3β究竟扮演什么角色仍待进一步探讨。