刘万青,董语迪,罗 清

(1.遵义医科大学附属医院 病理科,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学附属医院 临床医学公共实验中心,贵州 遵义 563099)

恶性肿瘤药物治疗中化学药物治疗、靶向药物治疗、免疫药物治疗作为主要的治疗方式[1-3],均不可避免的出现耐药的情况,极大的限制了药物的作用,进而导致预后较差。例如,在肝癌的化学药物治疗过程中,常因P-gp过表达、DNA损伤修复功能异常、肝细胞缺氧等产生耐药[4];在不同肿瘤的靶向药物治疗中,常因糖代谢、氨基酸代谢和脂质代谢异常导致耐药的发生[5];在三阴性乳腺癌的免疫药物治疗中,常因肿瘤细胞抗原水平下调、浸润T细胞的功能减弱等产生耐药[6]。因此逆转肿瘤细胞耐药是肿瘤治疗中亟待解决的问题。常规逆转药物如维拉帕米、奎尼丁、胺碘酮和环孢素A等普遍存在毒副作用大、靶点单一、价格昂贵等缺点,而越来越多的证据表明,中药中的天然活性成分能够显著提高化疗敏感性,可用作化疗敏化剂[7-8]。中药来源的天然活性成分具有价格低廉、高效、低毒、多靶点的优势,故在逆转肿瘤细胞耐药方面的作用愈发受到关注。

浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq)为百合科多年生草本植物,因其主产地在浙江省而得名。其干燥鳞茎是我国传统的大宗中药材,俗称浙贝、象贝、大贝、珠贝、元宝贝,被列为“浙八味”之一,历版《中国药典》均有收载。其味苦、性寒,归肺、心经,具有清热化痰、降气止咳、散结消肿的功效,对于风热或痰热咳嗽、肺痈吐脓、疮痈肿毒也有一定的功效。现代医学研究发现,浙贝母的主要成分包括生物碱、多糖、黄酮类成分、皂苷和挥发油等,具有止咳祛痰平喘、镇痛抗炎、抗溃疡、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及逆转肿瘤细胞多药耐药等功效[9-10]。现代医学中,复方甘草浙贝氯化铵片常用于治疗急慢性支气管炎引起的咳嗽、咳痰;浙贝母与乌贼骨组合制成的乌贝散,在治疗胃酸过多导致的胃及十二指肠溃疡效果甚好。浙贝母为药食两用药材,目前已获批作为清热化痰、散结解毒的保健功能性食品。现通过对浙贝母化学成分及其逆转肿瘤细胞耐药作用的相关研究进行综述,为进一步研究开发浙贝母天然活性成分作为肿瘤耐药有效逆转剂应用于临床提供参考。

1 浙贝母的主要化学成分

生物碱是浙贝母中主要的化学成分之一,分为异甾体类生物碱和甾体生物碱两大类,其中,异甾体生物碱包括贝母辛(peimisine)、贝母素甲(peimine)、贝母素乙(peiminine)、浙贝宁(zhebeinine)、浙贝宁苷(zhebeininosinoside)、梭砂贝母酮碱(delavinone)、环巴胺(cyclopamine)、鄂贝啶碱(ebeiedine)、去氢鄂贝啶碱(ebeiedinone)、浙贝丙素(puqiedinone)等;甾体生物碱包括Spirosol-5-en-3-yl acetate、Solasodine 3-b-D-glucopyranoside、(3beta,12alpha) -3,12-Dihydroxysolanid-5-en-1-one等[11-13]。Cui等[14]通过应用高分辨液质联用仪从浙贝母的鳞茎、花、花蕾、茎以及叶中鉴定出贝母辛(C27H42O3N)、贝母素甲(C27H46O3N)、贝母素乙(C27H44O3N)、去氢鄂贝啶碱(C27H46O2N)、鄂贝啶碱 (C27H46O2N)、浙贝宁苷(C33H56O8N)等37种生物碱及其同分异构体(图1)。其中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等都是浙贝母中最具活性的生物碱成分[15]。浙贝母的止咳祛痰平喘[16]、镇痛抗炎[17]、抗溃疡[18]、抗肿瘤[19]、逆转肿瘤细胞多药耐药[20]等功效均与其生物碱成分密切相关。

图1 浙贝母中部分生物碱的结构式

浙贝母中多糖的提取率约为7.4%,且无蛋白质、多酚、淀粉等物质[21]。李仕伟[22]通过使用线性离子阱-静电场轨道离子阱质谱仪对浙贝母多糖进行单糖组分定性分析,发现浙贝母多糖中单糖种类繁多,如葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、来苏糖、核糖等。同时根据浙贝母多糖定性分析结果,对其中的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸等6种含量较高的单糖进行含量测定,发现每克浙贝母多糖中葡萄糖的含量最高,约为60～72 mg,其他5种单糖含量均低于22 mg。目前研究表明,浙贝母中的多糖具有清除体外自由基、体外抗氧化、抗衰老等作用[23]。

浙贝母中还含有少量黄酮类成分,主要包括槲皮素、山奈酚及其苷。Cui等[14]利用高分辨液质联用仪对浙贝母中的黄酮类成分进行鉴定,鉴定出16个黄酮类成分,如槲皮素、山奈酚、槲皮素-7-O-芦丁糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖等。其中的代表性成分为山柰酚类化合物和槲皮素,它们具有较强抗氧化作用[24]。由于其抗氧化特性,它们可以保护细胞免受氧化应激、炎症和DNA损伤,并通过阻滞细胞周期进展和肿瘤细胞增殖以及诱导细胞凋亡来抑制多种肿瘤细胞的生长[25-27]。

浙贝母总皂苷含量约为1.724 %,主要包括西贝素苷、贝母素甲苷、伊贝碱苷A、平贝碱苷等,具有一定的抗炎作用[28-29]。顾健等[30]发现皂苷可减轻角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀、降低小鼠毛细血管通透性,提示其对急性炎症渗出过程具有一定的抑制作用。

另有研究者发现,浙贝母中含有38种挥发油成分,主要为十八烯酸甲酯类物质、苯乙醛、庚醛、辛醛、戊二醛和糠醛等[31-32],具有抑菌、抗炎、抗过敏、抗癌、抗微生物、驱虫、抗氧化等作用[33-34]。

除上述5种主要成分外,浙贝母中还含有丰富的不饱和脂肪酸,如亚麻酸(28.55%)和亚油酸(18.41%),具有潜在的抗氧化和镇痛活性[35]。浙贝母中含有尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷等多种核苷类成分[36-37]。研究表明,核苷类成分可以通过嘌呤和(或)嘧啶受体起到调控机体各种生理过程的作用,具有调节机体免疫功能、参与代谢、抗菌和抗病毒等多种作用[38]。另有文献报道,浙贝母中含有游离氨基酸和Ca、Fe、Zn、Mo、Se、Mn、Cu等人体必需微量元素[39]。浙贝母中重要活性成分及其药理作用概况总结(表1)。

表1 浙贝母中重要活性成分及其药理作用

2 浙贝母化学成分逆转肿瘤化学药物治疗耐药的研究现状

研究表明,浙贝母具有逆转肿瘤细胞耐药的作用。在白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等疾病中,浙贝母的天然活性成分均具有明显的体外逆转肿瘤细胞耐药的作用[42-47]。

2.1 生物碱对肿瘤耐药的逆转作用 现代药理研究发现,浙贝母中起逆转肿瘤细胞耐药的主要活性成分是生物碱,尤其是对贝母素甲、贝母素乙2种成分的研究较多。

浙贝母生物碱能够通过调控P-gp、多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein, MRP)、肺耐药相关蛋白(lungresistance-associateprotein, LRP)等蛋白的表达及减少药物外排、增加胞内药物浓度的机制,在多种肿瘤细胞中实现其逆转耐药的作用。在白血病中,胡凯文等[20]发现在以P-gp升高为主要耐药机制的耐药细胞株K562/A02和以MRP升高为主要耐药机制的耐药细胞株HL-60/ADR,贝母素甲对上述2种具有不同耐药机制的肿瘤细胞的逆转倍数约为5.7和5.6。王云飞等[45]在研究贝母素乙逆转胃癌细胞MDR、增强化疗药物对胃癌多药耐药裸鼠移植瘤的抑制作用中,发现联合用药组裸鼠移植瘤生长缓慢,治疗结束时,肿瘤平均体积为(0.66±0.42)cm3,显著低于模型组肿瘤平均体积(1.96±0.48)cm3(P<0.01),而阿霉素组肿瘤平均体积为(0.96±0.65)cm3,与模型组比较差异显著(P<0.05),提示贝母素乙可以增强胃癌耐药细胞移植瘤对阿霉素的敏感性,能够显著抑制胃癌耐药移植瘤的生长,其作用机制可能与P-gp表达降低、Cleaved Caspase-3表达升高有关。唐晓勇等[48]进行了贝母素甲逆转肺癌耐药细胞株A549/DDP的相关研究,研究结果显示,相比于顺铂组,川芎嗪及贝母素甲组切除修复互补基因1(excision repair cross-complementation 1,ERCC1)mRNA及LRP蛋白均明显降低(P<0.05),且贝母素甲组明显低于川芎嗪组,提示贝母素甲可通过下调LRP蛋白表达、抑制ERCC1 mRNA表达而逆转肺癌细胞系A549/DDP对铂类药物的耐药性。另有研究表明[49],贝母素甲与贝母素乙均能不同程度地抑制胃癌亲本细胞系SGC-7901和耐药细胞系SGC-7901/VCR的增殖能力,其中贝母素乙更具逆转胃癌细胞耐药的潜力,研究人员采用流式细胞仪检测胃癌亲本细胞系SGC-7901和耐药细胞系SGC-7901/VCR内阿霉素的平均荧光强度,发现贝母素乙(20 μg/mL)与阿霉素联用后,SGC-7901/VCR细胞内的平均荧光强度较单用阿霉素组增加了2.33倍,表明贝母素乙可明显恢复耐药细胞株对阿霉素提取和蓄积的能力,由此可见,贝母素乙可提高SGC-7901/VCR细胞对抗肿瘤药物的敏感性,是通过降低P-gp的表达、减少细胞内药物外排及诱导细胞凋亡等多种途径对肿瘤细胞耐药产生明显的逆转作用。

除此之外,浙贝母生物碱能抑制肿瘤细胞增殖并提高其对化疗药物的敏感性,进而逆转肿瘤细胞耐药。研究表明,在人小细胞肺癌A549细胞系、人乳腺癌MCF-7细胞系、人宫颈癌HeLa细胞系、人食管癌Eca-109细胞系、人肝癌HepG2细胞系中,贝母素乙与阿霉素联用能明显抑制肿瘤细胞的增殖,不同程度地增强上述5种肿瘤细胞对阿霉素的敏感性,提高化疗的成功率[50]。随后,研究人员发现,贝母素乙与奥沙利铂在一定浓度范围联合应用可有效抑制胃癌MKN45细胞的增殖,且具有协同效应,可使化疗药奥沙利铂在低浓度发挥药效,减少毒副反应[51]。随着研究的深入,发现贝母素乙可能是通过调节EGFR/FAK途径,抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,提高其对阿霉素的敏感性[52],该研究提示贝母素乙也许能作为新的化疗增敏剂。

浙贝母生物碱还可以通过阻滞细胞周期诱导肿瘤细胞凋亡,进而增加肿瘤细胞内抗癌药物浓度、逆转肿瘤细胞耐药。体外研究显示[53],在人急性髓系白血病细胞系KG-1a细胞中,贝母素甲可使KG-1a细胞G0/G1期细胞比例降低、G2/M期细胞比例升高,促进细胞从静止期进入有丝分裂期,进而提高化疗药物的敏感性,加强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。此外,在卵巢癌细胞中,贝母素甲能通过阻滞细胞周期、抑制细胞PCNA蛋白表达,进而发挥其对低剂量5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)的增敏作用,贝母素甲低剂量能增强5-FU作用,可能是通过使细胞停留在S期而较多摄入5-FU所致[47]。

除上述3种机制外,浙贝母生物碱逆转肿瘤细胞耐药还有其他机制。例如,贝母素甲可通过诱导细胞活性氧爆发,引起谷胱甘肽水平下降的机制,抑制多药耐药人白血病细胞系K562/A02的细胞活力,诱导其凋亡,从而逆转耐药的发生[54]。

2.2 多糖对肿瘤耐药的逆转作用 多糖是药用植物的主要活性成分之一,其单糖组成主要含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖[55]。浙贝母中多糖含量丰富,具有清除体外自由基、体外抗氧化、抗衰老等作用,却未见其逆转肿瘤细胞耐药的相关研究及报道。但有研究表明,其他中药中的多糖成分具有逆转肿瘤细胞耐药的作用。例如,艾芳芳等[56]通过实验发现枸杞多糖联合奥沙利铂处理后,通过抑制PMI/PI3K/AKT通路,可促进结肠癌细胞系HCT116-OXR细胞的凋亡,逆转HCT116-OXR细胞耐药,逆转倍数约为2.8。刘洪盛等[57]研究表明,青果多糖提取物可逆转胃癌5-FU耐药细胞系BGC823/5-FU对5-FU的耐药性,逆转倍数约为3.11,其机制可能是通过降低耐药基因GST-π和MDR1 mRNA及GST-π和P-gp的表达,减少5-FU的外排,提示青果多糖提取物在化疗药物增敏方面具有广阔的研究前景。Song等[58]采用了多种方法检测胃癌亲本细胞系SGC-7901和耐药细胞系SGC-7901/ADR细胞中黄芪多糖诱导的细胞凋亡情况,结果表明黄芪多糖不仅以时间和剂量依赖性的方式诱导胃癌细胞凋亡,还可以增强阿霉素对胃癌细胞的促凋亡作用,提示黄芪多糖可在一定程度上起到化疗增敏的作用。上述研究提示,浙贝母多糖在逆转肿瘤细胞耐药方面亦具研究价值。

2.3 黄酮类成分对肿瘤耐药的逆转作用 槲皮素是黄酮类成分的代表性成分之一,具有多种药理活性和生理活性,近年来的大量研究表明,它也是一种有效的多药耐药逆转剂。Chen等[59]研究发现,在肝癌中,槲皮素可通过阻断FZD7/β-catenin信号通路来增强人肝癌耐药细胞系BEL-7402中常规化疗剂5-氟尿嘧啶的功效。在乳腺癌中,槲皮素一方面通过提高雌激素受体的表达逆转乳腺癌细胞中的他莫昔芬耐药性,另一方面通过降低P-gp的表达和消除Y-box结合蛋白1核易位介导的癌症干细胞逆转乳腺癌的多药耐药[60-61]。在胰腺癌中,槲皮素通过调控RAGE/PI3K/AKT/mTOR信号轴显著提高了胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性,同时通过抑制P-gp的表达逆转了胰腺癌细胞对柔红霉素的耐药[62-63]。此外,在黑色素瘤中,槲皮素还可降低基因deltaNp73的表达提高其对替莫唑胺的敏感性[64]。因此,槲皮素具备作为肿瘤耐药有效逆转剂的潜力,在临床上有很好的应用前景。槲皮素是浙贝母黄酮类成分中代表性成分,目前尚未见有关浙贝母中槲皮素逆转肿瘤细胞耐药的报道,其对于肿瘤耐药的作用有待于进一步研究。

3 中药逆转肿瘤靶向药物与免疫药物治疗耐药的研究现状

由于靶向药物与免疫药物治疗的迅速发展,极大地提高了患者的生存率,并使其他难治性恶性肿瘤得到持续缓解,但依然受到原发性和获得性耐药性的限制。浙贝母中各种成分是否能够逆转靶向药物与免疫药物治疗过程中产生的耐药性尚未可知,行文至此未见相关文献报道。而今大量研究表明,部分中药能够逆转肿瘤靶向药物与免疫药物治疗产生的耐药性,增强临床疗效。例如,Pan等[65]通过实验发现,参芪扶正注射液通过抑制MAPK/SREBP1通路调节人非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性,参芪扶正注射液与吉非替尼的组合可增强吉非替尼与表皮生长因子受体的结合,从而恢复细胞对吉非替尼的敏感性。黄晓明等[66]发现,中药复方金复康口服液能通过提高人非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞系PC9/R裸鼠皮下移植瘤PTEN、PDCD4蛋白的表达,抑制PI3K/AKT通路活化的信号,并降低miRNA-21的表达从而对人非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞系PC9/R起到增敏作用。在胰腺癌中,中药单体仙鹤草素在体内和体外均能明显抑制胰腺癌细胞的增殖,同时,仙鹤草素通过抑制ERK和AKT信号通路抑制胰腺细胞的增殖,有望成为逆转胰腺癌靶向药物耐药性的逆转剂或增效药物[67]。另有研究表明,地榆通过阻断结直肠癌中的PD-8/PD-L1相互作用,有效增强肿瘤浸润CD1+T细胞活化,增强抗PD-1的疗效[68]。因此,浙贝母或可逆转上述两种疗法产生的耐药性,其机制有待进一步研究。

4 展望

浙贝母药源丰富,药理作用明显,且具有价格低廉、毒性较低、人体耐受性好、多个作用靶点等优点,具有良好的应用和开发前景。根据近年来现有文献对浙贝母的化学成分及其逆转肿瘤细胞耐药的作用进行总结与归纳,以期能够激发更多研究者对浙贝母逆转肿瘤细胞耐药作用的兴趣,探究更深层次的作用机制,从而促进浙贝母有效成分的提取与开发,制造新型天然逆转试剂,为更多肿瘤患者带来益处。

然而,目前对浙贝母逆转肿瘤细胞耐药的研究大多仍停留在体外实验和动物实验,仍需后期实验反复验证其逆转肿瘤细胞耐药的具体作用机制。虽然对浙贝母逆转肿瘤细胞耐药作用充满信心,但接下来仍会有许多难题亟待解决,包括：(1)浙贝母各种成分之间是否具有协同逆转肿瘤细胞耐药作用;(2)浙贝母生物碱发挥逆转肿瘤细胞耐药作用的具体剂量;(3)浙贝母中其他可逆转肿瘤细胞耐药的活性成分是否具有研发价值;(4)浙贝母作为中草药,仍需明确其不良反应与服用禁忌。