陈 欣,曹誉龄,杨颖馨,曹 昊,敬小丽,郑月茂,缪瑞琦

(1.成都市锦江区疾病预防控制中心检验科,四川 成都 610021;2.成都中医药大学医学技术学院生物分析教研室,四川 成都 611130)

猴痘病毒是痘病毒科的一员,是20世纪70年代在北非发现的一种病毒性人畜共患病。猴痘病毒可通过接触病变体液、呼吸道飞沫和受污染的物质在人与人之间传播[1]。2022年5月,非洲以外非流行地区的猴痘流行开始受到全世界的关注。2022年7月23日,世界卫生组织宣布猴痘为国际关注的突发公共卫生事件。据世卫组织数据,自猴痘疫情暴发以来,总共有111个国家和地区向世卫组织报告了超过8.7万例病例,包括140例死亡病例。2022年9月重庆报道了中国首例猴痘病例,2023年6月,成都也发现了猴痘,感染人数迅速上升。

快速识别疫情及聚集性对感染控制至关重要。污水监测已被认为是评估病原体传播的有力工具,已成功用于追踪SARS-CoV-2及其变体。研究表明,猴痘病毒DNA会从唾液、粪便、尿液、精液和皮肤病变中脱落[2],病毒基因组可能存在于污水中。因此,在2023年7～9月成都猴痘流行期间,跟踪监测了成都市第九污水处理再生水厂的污水,检测并分析污水中的猴痘病毒含量和基因特征,研究污水中猴痘病毒浓度与阳性报告病例发生率的相关性,探讨环境监测作为猴痘疫情监测补充手段的可行性和重要性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 对成都市第九污水处理再生水厂未经消杀处理的污水进行采样,采样方式为智能水质采样器24 h间断采样(即24 h不同时间所采集的瞬时水样混合为1个样本),采样体积为300 mL,每周采集检测2次,共检测了2023年7～9月的26个样本。

1.1.2 试剂 聚乙二醇购于生工生物工程股份有限公司,氯化钠购于成都科隆化学品有限公司,提取试剂盒和猴痘DNA检测试剂盒购于硕世生物科技股份有限公司,另一种猴痘DNA检测试剂盒购于上海仁度生物科技股份有限公司,测序及全基因组分析试剂和系统购自杭州柏熠科技有限公司,均在效期内使用。

1.2 方法

1.2.1 样本的处理与富集 污水样本经0～4℃冷藏运输到实验室,立即在60 ℃水浴30 min进行灭活。污水的富集浓缩按照国标WS/T 799-2022[3]中的聚乙二醇沉淀法进行,将105 mL污水富集浓缩到0.6 mL。

1.2.2 实时荧光PCR检测及定量 猴痘病毒DNA的提取使用硕世核酸提取试剂盒,按照试剂使用说明书进行,用200 μL污水富集液提取50 μL总核酸。猴痘病毒DNA检测按照《猴痘防控方案(2023版)附件7：猴痘病毒实验室检测技术指南》[4]进行,检测采用2个厂家的成品试剂盒,以猴痘病毒F3L基因为目标基因,任一试剂盒检测结果阳性即判定为猴痘病毒DNA阳性。用中国计量科技院科学研究院猴痘病毒突变型F3L基因假病毒标准物质制备标准曲线,标准曲线的纵坐标为CT值,横坐标为浓度以10为底数的对数值,依据标准曲线计算样本中猴痘病毒的浓度,根据实验操作过程中的实际浓缩倍数,将核酸样本中的猴痘病毒浓度换算成污水样本中猴痘病毒的拷贝数,单位为拷贝/毫升(copy/mL)。

1.2.3 扩增子测序 检测阳性的样本均进行扩增子测序。使用杭州柏熠的猴痘病毒全基因组捕获试剂盒进行猴痘病毒全基因组靶向扩增与富集,使用illumina nextseq2000进行二代测序,数据比对分析参考nextclade2.14.0猴痘病毒分子分型系统(网址https：//clades.nextstrain.org/;更新时间2023-08-01)进行比对和注释,参考序列Reconstructed ancestral MPXV(ancestral),依据杭州柏熠科技有限公司猴痘全基因组分析软件系统(数据库构建于GISAID猴痘病毒分子系统(https：//gisaid.org/)进行溯源,并与本省输入、本土病例猴痘病毒基因组数据库进行分析、比对。

2 结果

2.1 污水中猴痘病毒检出情况及含量 在26个污水样本中,有8个样本检测出猴痘病毒阳性,检出率30.8%(8/26)。结果见表1。

表1 污水中猴痘病毒含量及猴痘阳性病例数

2.2 猴痘基因组分型及溯源 8个阳性水样经测序后,得到175 266 746条聚类序列,经过滤拼接后,得到173 707 771条聚类序列,均为西非分支Ⅱb C.1型。溯源的部分结果见表2。由表2可以看出,污水中检出的猴痘病毒基因和临床株非常相似,与2022年猴痘疫情暴发的基因组密切相关。

表2 部分污水中猴痘病毒的溯源

2.3 相似性分析 以hMpxV_China_YN-CDC-0001_2023猴痘病毒Ⅱb B.1.3为参考序列构建进化树(图1),并将所得的分离株序列进行聚类分析(图2)。由图1可看出,进化分支长度均小于0.1,说明进化支变化的程度很小,污水中检出的猴痘病毒基因与参考序列差异小,进化距离近,亲缘关系密切。由图2可看出,各分离株序列之间也非常相似,相似性为99%以上,提示引起本次成都疫情的猴痘病毒的传播链比较单一。

图2 污水分离株中猴痘病毒DNA的相似性

3 讨论

本次研究的采样地点为成都市第九污水处理再生水厂,其是西南地区最大的再生水厂,每天污水处理规模100万吨,服务于广大的锦江流域,服务面积约195平方公里,服务人口600万人,其辖区内有成都市公共卫生临床医疗中心,成都市肛肠医院等大型医院,九眼桥、太古里等大型娱乐场所集合地。其中,成都市公共卫生临床医疗中心是本地最大的收治猴痘患者的定点医院,九眼桥片区的娱乐场所是男男性行为人群主要的聚会交友地。在2023年6月成都检出了首例猴痘阳性患者后,从7月到9月,成都市锦江区报告了猴痘阳性病例75例,其中7月34例,8月37例,9月4例(阳性病例数据来源于中国疾病预防控制信息系统的猴痘监测报告管理模块,阳性确诊病例的判定标准为：经实验室检测在咽拭子、肛拭子或痘痂任一标本中猴痘病毒核酸阳性[4])。本次研究检测的结果也与成都本次猴痘阳性感染的报道情况基本一致：7月感染人数快速上升,8月到达顶峰,9月数量大幅下降,所以在7月下旬首次在污水中检出猴痘病毒,8月污水中病毒浓度升高,9月病毒浓度快速下降,到9月下旬降至低于检出限或阴性。由基因测序的结果可以看出,污水中的猴痘病毒都与报道的临床毒株高度相似,所以可以推定污水中的猴痘病毒均来自于患者或携带者的人体脱落物或排泄物。污水中猴痘病毒浓度与阳性报告病例的发生率基本呈正相关,表明污水监测是监测猴痘感染传播趋势的可行方法[5-6]。

污水监测是监测传染病威胁的一种敏感且具有低成本效益的辅助公共卫生工具[7]。例如猴痘病毒,在中国主要经由男男性行为人群密切接触传播[8],部分患者基于羞耻和偏见不愿就医,还有部分症状轻微的患者和无症状携带者未去就医,所以,社区中的真实患者和携带者的数量可能远高于报道的阳性病例数[9]。这也可能是在本次猴痘疫情中,阳性病例数并不多,但仍可在污水中检出猴痘病毒的原因之一。污水监测作为一种独立于个人检测的补充性监测方法,它代表了来自社区的复合生物样本[10]。排入污水的病原体的存在和浓度提供了相关疾病的信息,而无需个人层面的任何参与,从而为公共卫生机构和临床医生提供了一种获得疾病流行态势感知的新手段[11-12]。当污水监测提示某传染病原广泛存在或高于日常水平时,可以提高公共卫生响应水平,提醒临床医生,并指导受影响地区的资源(例如检测、疫苗和治疗药物)和人员的分配。

本次猴痘病毒检测前处理,依据的是污水中新型冠状病毒的浓缩方法,但猴痘患者远少于新型冠状病毒患者,污水中猴痘病毒载量也远低于新型冠状病毒[13]。在下一步的研究工作中,本课题组还将研究影响污水中猴痘检测的因素[14],包括采样时间地点、感染者的病毒脱落、环境持久性等[15],探讨研究优化浓缩和检测方法,以提高污水中猴痘检测的敏感性,从而使污水中猴痘监测可用于非流行地区的猴痘的哨点监测,并且融会贯通,让污水中的病原体(如流感、手足口病、诺如等常见传染病)监测作为社区一级的哨点早期监测,真正成为综合性监测的有效补充方法。