何 念,曲 颜,张念杰,万 磊,杨雪峰

(遵义医科大学第二附属医院 胃肠外科,贵州 遵义 563006)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道肿瘤之一。2019年全球范围内结直肠癌新增发病率和死亡率均分别位于男女性癌症病例的第3位[1]。由于CRC发病隐匿强的原因,CRC确诊时已处于中晚期,对于中晚期结直肠癌患者而言,治疗手段主要采用外科手术切除,辅以放化疗的治疗手段。但随着化疗药物如5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的广泛使用,CRC逐渐对临床化疗药物产生获得性耐药性,获得性耐药是CRC复发及影响预后的重要因素,严重影响患者的生存率[2-3]。MicroRNAs (miRNAs)已经成为多种肿瘤的检测、诊断、治疗选择、预后及调节机制中的潜在标志物[4]。miR-210在结直肠癌发生、发展中起到一个至关重要的作用。研究发现miR-210能够抑制结直肠癌细胞周期进程,上调细胞ROS集聚,诱导细胞凋亡[5]。血清中miR-210的表达可能是结直肠癌诊断和预后的潜在非侵入性标志物[6]。研究证实miR-210-3p下调后,通过促进DNA损伤修复及代谢重编程,进而降低结直肠癌细胞对5-FU的药物敏感性[7]。

目前,miR-210对结直肠癌细胞顺铂耐药的影响及机制还不是特别清楚,因此,本项目研究miR-210在人结直肠癌细胞株及顺铂耐药细胞株中的表达,探索miR-210对人结直肠癌细胞增殖、凋亡调控的影响及潜在机制,为后续深入研究结直肠癌细胞对顺铂类药物敏感性的研究做坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌细胞顺铂耐药株HCT-116/DDP由本实验室构建及保存(耐药指数IR：126.211);HCoEpiC人正常结肠上皮细胞购自于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司;人结直肠癌细胞(HCT-116、HT-29、SW620)购自于中国科学院细胞库;miR-210 mimics及inhibitor购自于广州锐博生物;顺铂购自德国Merck公司;Cell-Counting-Kit-8(CCK-8细胞活力检测试剂盒)、Annexin V-FITC/PI检测试剂盒、RIPA细胞快速裂解液购自北京索莱宝生物技术有限公司;McCoy's 5a培养基、LipofectamineTM3000脂质体转染试剂、优质胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、TRIzol购自美国Thermofisher;PVDF膜、化学发光试剂购自美国 Millipore 公司;SYBR Green PCR试剂盒购自于美国KAPA Biosystems公司;PrimeScriptTMRT Master Mix购自于日本TAKARA;兔抗Bad、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、GAPDH购自于英国abcam;兔抗ABCG2、MRP2、P-gp、Wnt3a、β-Catenin购自于中国Bio-Swamp;HRP偶联抗兔二抗购自武汉Proteintech;其他试剂均为国产分析纯。T100-Thermal Cycler型PCR仪、CFX-96型荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司;MultiskanFC酶标仪购自美国Thermofisher公司;超净工作台购自于中国苏州智净净化设备有限公司;CO2恒温培养箱购自于美国Thermofisher公司;倒置荧光显微镜购自于德国Leica公司;NovoCyteTM流式细胞仪购自Novo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HCT-116、HT-29、SW620、HCT-116/DDP细胞快速复苏后,选用添加终浓度为10%FBS的各细胞对应的细胞培养基,置于37 ℃、体积分数为5% 的CO2培养箱中培养,待细胞长满培养瓶80%～90%时,按照1∶2～3的比例传代,备用。

1.2.2 qRT-PCR检测 收集2.1中培养好的细胞,Trizol裂解,提取RNA,PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录成cDNA后,以U6为内参,qRT-PCR检测各细胞中miR-210的表达水平,反应程序：95 ℃,3 min;95 ℃,5 s;56 ℃,10 s;72 ℃,25 s;39 cycles;65 ℃,5 s;95 ℃,50 s;扩增引物见表1,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的HCT-116、HCT-116/DDP细胞,按照2×104cells/mL的细胞量接种到6孔板,利用LipofectamineTM3000转染试剂将miR-120 mimics及inhibitor片段转染到HCT-116/DDP细胞中24 h后,进行相关干预或者检测。HCT-116/DDP在转染后,将细胞分成Control组、mimics组、inhibitor组、cisplatin(DDP)处理组、cisplatin与mimics或者inhibitor联合组;其中cisplatin按照80 μg/mL的终浓度作用24 h。

1.2.4 细胞活力评价 细胞按照1.2.3分组转染并干预对应时间点后,收集各组细胞,按照CCK-8试剂盒操作说明,每孔加入10 μL CCK-8工作液,在37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中继续培养0.5 h,用酶标仪(450 nm)检测各组细胞的吸光值(OD值)。

1.2.5 细胞凋亡检测 细胞按照1.2.3分组转染并干预对应时间点后,收集细胞,按照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明,加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色工作液,轻轻摇晃,室温避光静置10～20 min后,置于冰盒中,流式细胞仪上机检测,NovoExpressTM细胞凋亡分析软件进行凋亡数量分析。

1.2.6 Western blot检测 细胞按照1.2.3分组转染并干预对应时间点后,选用高强度RIPA裂解细胞,冰盒中静置20 min后, 4 ℃ 10 000～14 000 g离心3～5 min,取离心后的细胞上清,BCA定量后,按照每孔20 μg蛋白量上样,SDS-PAGE电泳后,转膜,分别以兔抗Bad(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Cleaved-Caspase-3(1∶800)、ABCG2(1∶1 000)、MRP2(1∶800)、P-gp(1∶1 000)、Wnt3a(1∶1 000)、β-Catenin(1∶500)及GAPDH(1∶10 000),4 ℃冰箱避光静置过夜后,TBST溶液漂洗3次,加入HRP偶联的抗兔二抗。加入ECL发光液后,利用全自动化学发光分析仪扫描膜,通过TANON GIS软件读取各蛋白相关条带的灰度值。

2 结果

2.1 miRA-210抑制结直肠癌细胞增殖和促进细胞凋亡 qRT-PCR检测发现,与HCoEpiC人正常结肠上皮细胞相比,结直肠癌细胞(HCT-116、HT-29、SW620)及HCT-116/DDP细胞中miR-210的表达显著降低(F=64.54,P=0.00);与亲本细胞HCT-116比较,顺铂耐药细胞株HCT-116/DDP中miR-210的表达进一步降低(t=4.102,P=0.000 8,图1A)。利用miR-210 mimics、miR-210 inhibitor分别转染HCT-116及HCT-116/DDP细胞后,CCK-8检测发现,与Control组比较,miR-210 mimics能够显著抑制HCT-116(t=5.379,P=0.0058)、HCT-116/DDP(t=7.685,P=0.0015)细胞活力,而inhibitor则上调细胞活力;进一步比较发现,miR-210 mimics对HCT-116/DDP的抑制作用显著高于HCT-116细胞(t=5.645,P=0.004 9,图1B)。流式细胞术检测发现,与Control组比较,miR-210 mimics能够显著促进HCT-116(t=7.846,P=0.0014)、HCT-116/DDP(t=8.299,P=0.0012)细胞凋亡,而inhibitor则抑制细胞凋亡(图1C)。以上结果提示miR-210抑制结直肠癌细胞增殖和促进细胞凋亡,miR-210对HCT-116/DDP的抑制作用更明显。

A：RT-qPCR检测不同细胞中miR-210的表达;B：CCK8检测miR-210对HCT-116和HCT-116/DDP细胞增殖的影响;C：流式细胞术检测miR-210对HCT-116和HCT-116/DDP细胞凋亡的影响。**：与对照组相比,差异显著, P< 0.01。图1 miR-210抑制结直肠癌细胞增殖和促进结直肠癌细胞凋亡

2.2 miR-210促进HCT-116/DDP细胞对顺铂的敏感性 CCK-8分析发现,与Control组比较,miR-210 mimics能抑制HCT-116/DDP细胞的活力(t=5.691,P=0.004 7),DDP与Control组比较,差异无统计学意义(t=2.416,P=0.073 1);与DDP组比较,DDP+mimics联合组能够显著抑制细胞活力(t=7.969,P=0.001 3,图2A)。细胞凋亡检测发现,与Control组比较,miR-210 mimics促进HCT-116/DDP细胞凋亡(t=18.970,P=0.000),DDP与Control组比较,差异无统计学意义(t=1.847,P=0.138 4);与DDP组比较,DDP+mimics联合组能够显著促进细胞凋亡(t=13.450,P=0.000 2,图2B～C)。miR-210 inhibitor与mimics的作用相反。以上结果提示miR-210可能促进HCT-116/DDP对顺铂的药物敏感性。

2.3 miR-210调节HCT-116/DDP细胞凋亡相关蛋白表达 Western blot检测发现,与Control组比较,miR-210 mimics及DDP能够显著促进Bad(t=5.913,P=0.0041;t=3.221,P=0.0323)、Cleaved Caspase-3(t=7.612,P=0.0016;t=3.063,P=0.0376)的表达,抑制Bcl-2的表达(t=11.790,P=0.0003;t=3.540,P=0.024);与DDP相比,mimics+DDP组能够进一步促进Bad(t=6.444,P=0.0030)、Cleaved Caspase-3(t=10.400,P=0.0005)的表达,抑制Bcl-2(t=20.710,P=0.000)的表达;miR-210 inhibitor则得到相反的结果(图3)。

*：与对照组比较,P< 0.05;**：与对照组比较,P< 0.01;##：与DDP组比较,P<0.01。图3 miR-210促进HCT-116/DDP细胞的凋亡

2.4 miR-210调节HCT-116/DDP细胞耐药相关蛋白表达 Western blot检测发现,与Control组比较,miR-210 mimics及DDP能够显著抑制p-gp(t=5.345,P=0.0059;t=7.54,P=0.0018)、MRP2(t=4.824,P=0.0085;t=7.504,P=0.0017)、ABCG2(t=4.842,P=0.0084;t=6.040,P=0.0038)耐药相关蛋白的表达;与DDP相比,mimics+DDP组能够进一步抑制p-gp(t=4.726,P=0.0091)、MRP2(t=15.66,P=0.000)、ABCG2(t=4.449,P=0.0013)耐药相关蛋白的表达;miR-210 inhibitor则得到相反的结果(图4)。

2.5 miR-210抑制Wnt/β-Catenin通路的激活 与Control组比较,miR-210 mimics及DDP能够显著抑制Wnt3a(t=6.293,P=0.0033;t=7.157,P=0.0020)、β-Catenin(t=7.517,P=0.0017;t=13.240,P=0.0002)的表达;与DDP相比,mimics+DDP组能够进一步抑制够显著抑制Wnt3a(t=5.827,P=0.0043)、β-Catenin(t=6.571,P=0.0028)的表达;miR-210 inhibitor则得到相反的结果(图5)。

**：与对照组比较,P< 0.01;##：与DDP组比较,P<0.01。图5 miR-210抑制HCT-116/DDP细胞中Wnt/β-catenin信号通路活化

3 讨论

耐药性是影响CRC预后以及复发的重要原因,严重影响患者的生存率,深入探讨耐药机制,提高化疗药物的治疗效果,促进CRC的治愈率均具有重要的意义[3,8]。目前耐药机制主要牵涉肿瘤干细胞、药物的吸收及外排、DNA损伤修复等多种渠道,其机制包括PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-Catenin通路等[9-10]。但是,人结直肠癌细胞对顺铂药物的具体耐药机制,目前还不十分明确。本研究主要是通过HCT-116/DDP株观察miRNA-210与其耐药性的关系及机制。

MicroRNAs (miRNAs)在肿瘤发生及发展中具有重要作用,miRNA可以通过调控其靶基因的表达、信号通路的激活/抑制等多种渠道来影响肿瘤细胞的耐药性[11]。miR-222及miR-519c能够调控肿瘤细胞的药物敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡[12-13]。本研究发现,miR-210在结直肠癌的细胞中显著下调,在顺铂耐药细胞中,其表达量进一步下调,显示miR-210可能参与其药物敏感性的调节。利用miR-210 mimics转染后发现,miR-210能够显著抑制结直肠癌细胞活力、促进细胞的凋亡,并且miR-210 mimics对HCT-116/DDP的抑制作用显著高于HCT-116细胞。

化疗药物促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要机制之一[14]。本研究发现miR-210mimics能够显著促进促凋亡蛋白Bad、Cleaved-Caspase-3的表达,而抑制抗调蛋白Bcl-2的表达,同时miR-210 mimics能够加强顺铂所引起的细胞凋亡蛋白的表达改变。

肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与细胞跨膜蛋白的表达水平密切相关,此类蛋白质可以直接抑制细胞内化疗药物水平[15]。能量依赖型 ATP 结合盒式(ATP-binding cassette,ABC)外排转运蛋白的表达水平,与肿瘤细胞多重耐药(multidrug resistance,MDR)的发生关系密切。p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是最重要的 ABC 转运蛋白之一,属于ABCB 家族,由ABCB1(mdr1)基因编码翻译而来,并由2个同源部分组成。P-gp 在包括肝癌细胞在内的各种 MDR细胞中的表达均显著升高[16-17],过表达P-gp可降低常规化疗药物在肿瘤细胞内的浓度,进而抑制其疗效[18]。ABCG2 也是一种本构性表达的 ATP 结合盒(ABC)转运蛋白,被称为乳腺癌耐药蛋白(BCRP),是一种多药物转运体[19]。沈晓红等[20]研究发现 ABCG2 表达水平与乳腺癌患者的耐药性呈正相关,与化疗疗效呈负相关。近年来发现,多耐药相关蛋白 2(Multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)也是重要的药物转运蛋白。本研究发现,miR-210抑制P-gp、ABCG2及MRP2的表达,进而促进HCT-116/DDP细胞对顺铂的药物敏感性。

研究证明,Wnt/β-catenin 通路的异常激活与肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤的进展关系密切[21]。最近研究显示,β-catenin 在乳腺癌耐药细胞株中被异常激活,并可通过调控 P-gp得表达促使乳腺癌细胞耐药性增强[22]。本研究发现,在HCT-116/DDP耐药株细胞中,Wnt3a和β-catenin的表达增加,但miR-210能够抑制HCT-116/DDP耐药株细胞中Wnt3a和β-catenin的表达。这些结果显示miR-210调节HCT-116/DDP细胞对顺铂药物敏感性可能与Wnt/β-catenin通路有关。

本研究发现,miR-210能够抑制结直肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能是通过影响Wnt/β-catenin 通路来抑制耐药相关蛋白(P-gp、ABCG2、MRP2)的表达,最终促进HCT-116/DDP耐药细胞对顺铂的药物敏感性,但具体的调控作用机制,还有待深入研究。并且,本研究通过DDP的结直肠癌细胞耐药株观察miRNA-210与耐药性的关系及机制,为后续深入研究miR-210与顺铂类药物敏感性的关系打下坚实的基础。