申福国 孔维丽 孙文才 郭 浩 姜 鑫 修 姜 肖文龙 于政恩 金 松

（1.齐齐哈尔医学院附属第三医院骨外科，黑龙江 齐齐哈尔， 161000；2.齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸内科，黑龙江 齐齐哈尔， 161000）

随着社会的发展，创伤、慢性炎性反应、老龄化等导致的关节软骨损伤发病率越来越高[1-2]。软骨组织为特殊的结缔组织，其分化性较强且缺乏血管、神经及淋巴结构[3]。软骨组织损伤后自我修复能力有一定局限性，如不能进行很好修复，将来可能发展成骨性关节炎。因此，采用有效的方法治疗早期关节软骨损伤，阻止或减缓软骨损伤的发展，对降低骨性关节炎的发病率起到十分重要的作用。

目前，临床中治疗膝关节软骨损伤主要为自体软骨移植手术、关节镜下微骨折手术、同种异体软骨移植手术、生物支架移植手术等治疗方法，但是临床中各种治疗方法均存在一定局限性，其临床治疗效果并不可观[4-6]。临床患者软骨损伤后很难修复到正常软骨组织，临床通过各种方法只能促进软骨修复及软骨搬运移植，这也一直为骨科医生面对的难题。随着组织工程学发展，软骨再生及支架材料的兴起，给软骨损伤患者带来了福音[7]。组织工程学领域涵盖了生命科学和材料工程学等相关学科，希望通过组织再生从根本上解决组织或器官损伤、缺失所引起的相关临床疾病，在现今疾病治疗中占有重要地位。种子细胞、生物材料和生物活性因子，是组织工程的三个重要部分[8]。

人骨组织是一种含有有机成分和无机成分的复杂结缔组织，其中无机成分主要是羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA），人骨中磷灰石的含量在60%～70%，而磷灰石作为人体的主要骨矿物质，具有良好的生物学性能，而被大量地应用在骨修复材料领域。目前在骨修复研究领域已经研究出各种羟基磷灰石复合材料，其中较为成熟的是纳米级羟基磷灰石，因其空间立体结构为晶体结构、尺寸，与人体骨组织非常接近，且羟基磷灰石能够很好地与正常骨组织相结合，形成稳定结构。羟基磷灰石具有良好的生物相容性与成骨活性，在生物体内可提供早期的骨强度和骨长入基石。

目前国内外羟基磷灰石已经在临床骨缺损中得到很好运用。人骨中还存在微量的稀土元素，其中就包括含量较少的钆元素（Gadolinium，Gd），微量稀土元素化合物对细胞增殖及分化有“Hormesis”效应[9]。有研究表明稀土元素微量释放对细胞有“高抑低促”的作用，也就是高浓度的稀土元素能抑制细胞增殖，低浓度的稀土元素能够促进细胞的增殖，同样作为镧系中排名第8 的钆元素也具备对细胞“高抑低促”的作用[10-11]。本研究利用羟基磷灰石为基石和微量稀土化合物钆促进细胞增殖特性，设计出一种新型复合支架材料，有望为临床软骨缺损提供新的支架材料。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂见表1，主要仪器见表2。

表1 主要试剂

表2 主要仪器

1.2 主要方法

目前对于羟基磷灰石粉体的合成方法主要分为两大类别，即液相合成法和高温固相合成法，然而对于纳米粉体的合成均为水液合成方法来完成。目前，化学材料方面液相合成法中主要有：水解法、水热反应法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、气溶胶分解法、微乳液法及超声波法等[12]。但是目前上述方法各有优缺点，为克服各种方法不足，采用多种方法组合进行制备，获得很好效果。本研究查阅刘天健[13]研究参考过程通过均相沉淀法进行制备，具体如下。

1.2.1 制备Ca（H2P04）2·H20 晶体

取85%磷酸按照磷酸:水=4:1（体积比）稍加稀释后缓慢滴入Ca（OH）2悬浊液，获得澄清溶液后，在140 ℃烘箱中烘10～12 h，在85～95 ℃时结晶析出片状无色晶体即Ca（H2P04）2·H20 晶体。

1.2.2 纳米掺钆羟基磷灰石的制备过程

（1）取上述结晶溶解成Ca（H2P04）2·H20 溶液，稳定后加入饱和Ca（OH）2溶液，强力搅拌2 min，待溶液完全反应后进行下一步操作。

（2）根据不同的掺钆比例（本研究制备0%、1%、5%、10%和15%含钆化合物羟基磷灰石材料，以备后期实验用），加入不同量的饱和的Ca（OH）2溶液，其配比条件是根据参考刘天健[13]研究，保证摩尔比（Ca+Gd）/P=1.67 的条件下，不同的Ca、Gd 含量与加入饱和的Ca（OH）2溶液量。

（3）取干燥无水的Gd（N03）3晶体，根据Ca、Gd 含量加入上述溶液后充分反应后静止5 min，加入一定量的分散剂，检测pH，加入NH3·H2O 调试，pH 为7 左右。

（4）取上述溶液用超声处理10 min，1 h/次，连续5 个周期，最后静置获得胶冻状备用。

（5）将溶胶状液体低温冷冻24 h，温度设置为-20 ℃，干燥后再200 ℃煅烧获得n-Gd/HAP 粉末

（6）取获得的n-Gd/HAP 粉末研磨放置在圆柱形磨具内获得含钆羟基磷灰石复合材料。

1.3 含钆化合物的羟基磷灰石复合支架的扫描电镜观察

将获得的钆化合物的羟基磷灰石复合支架进行表面喷金过夜；待满足要求后将喷金后的钆化合物的羟基磷灰石复合支架置于扫描电镜下进行观察。

2 结果

2.1 采用均相沉淀法获得的含有钆化合物的羟基磷灰石外观图

获得含钆化合物的羟基磷灰石粉末放置在圆柱形磨具内制备圆柱状复合支架，获得外观支架形态约高5 mm 直径为3 mm 大小圆柱形（为下一步体内植入试验完整匹配骨缺损区域），大体形态观察可见支架有大量空隙结构，空隙结构有利于细胞容纳繁殖及骨组织长入。复合支架具有大量稀疏多孔结构也就具有大的表面积及高孔隙率,这样有利于细胞粘附、营养物质输送以及细胞代谢产物排出，更有助于细胞的充分渗透，见图1。

图1 含钆化合物的羟基磷灰石复合支架大体侧面外观

图2 钆化合物的羟基磷灰石复合支架大体正面外观

2.2 含钆化合物的羟基磷灰石复合支架扫描电镜结果

对含钆化合物的羟基磷灰石复合支架进行电镜扫描，可见支架内大量疏松交错蜂窝样空隙结构，空隙率高，连通性好；其电镜下表面观察可见含钆化合物的羟基磷灰石颗粒呈现不规则多边形结构，排列错综复杂，相互交织形成三维立体微孔结构，见图3。

图3 含钆化合物的羟基磷灰石复合支架电镜图（1.00 μm）

3 讨论

目前在组织工程研究领域，国内外已经取得了一定成果，但是由于材料性能及制备过程均存在诸多亟待解决的问题：人体关节骨软骨复合组织是组分和结构较为复杂的功能组织，理想的构建策略不是将再造的软骨和骨组织简单地缝合或粘合在一起。设计仿生功能结构有望解决再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳、易松动等问题，研发新型支架材料已成为目前骨科组织工程领域热门课题。

羟基磷灰石（HA）是目前研究较多的活性生物材料之一，因其具有良好的生物相容性和一定的力学性能，近年来备受青睐。人骨中磷灰石的含量在60%～70%，而羟基磷灰石作为人体的主要骨矿物质，具有良好的生物学性能，而被大量地研究应用于骨修复材料领域，因此，目前在骨修复研究领域已经研究出各种羟基磷灰石复合材料，其中较为成熟的还是纳米级羟基磷灰石，因其空间立体结构为晶体结构、尺寸，与人体骨组织非常接近，大量研究发现纳米级羟基磷灰石具有无毒性、无刺激性、无免疫原性、无不良反应等优点，并且具有很好的生物相容性及优良的骨传导性和诱导成骨性，且羟基磷灰石能够很好地与正常骨组织相结合，形成稳定结构[14-16]。羟基磷灰石具有良好的生物相容性与成骨活性，在生物体内可提供早期的骨强度和骨长入基石。

近年来，随着对稀有元素深入研究发现，高分散均匀的稀土纳米粒子（NPs）的成功合成促使人们进一步探索含Gd的微/纳米材料在生物医学中的应用[17-19]。LARANJEIRA等[20]使用NaGdF4NPs 探针在体内进行肿瘤靶向MR 成像。XU 等[21]研究了NaGdF4 释放了低水平的自由离子，所以它是无毒的。合成的羟基磷灰石纳米粒子（HA NPs）在化学成分和结构上与天然骨相似。与HA 陶瓷相比，HA NPs 具有更大的纳米尺寸和比表面积，因此具有更好的生物降解性和生物活性。GdPO4等稀土磷酸盐具有毒性低、分子稳定性好等优点，目前在临床给药或肿瘤治疗方面得到很好运用[22-24]。人骨中还存在微量的稀土元素，其中钆元素在临床运用较多，目前安全性相对较好。本研究设想运用稀土元素钆对细胞的影响存在“Hormesis”效应，在体内少量释放，促进细胞增殖。

获得含钆化合物的羟基磷灰石形态大体满意，空隙率较高，基本强度较好，已经满足实验基本需求，扫描电镜中发现含钆化合物的羟基磷灰石复合支架紧密排列、相互连接的同时保持了相互之间微孔的存在。材料的微孔隙率一直不容易被支架材料研究中所重视，然而在组织工程支架材料评估方向，大孔隙和相互之间连通性良好的微孔隙共同存在，能够更好地促进成骨细胞在支架上的粘附和生长，为支架材料在组织工程骨中发挥更大的作用，奠定了良好的基础条件。本实验获得的含钆化合物的羟基磷灰石复合支架电镜下扫描可见支架内大量疏松交错蜂窝样空隙结构，空隙率高，连通性好；对其电镜下表面观察可见含钆化合物的羟基磷灰石颗粒呈现不规则多边形结构，排列错综复杂，相互交织形成三维立体微孔结构，为将来进行种子细胞的增殖、分化提供了前期基础条件。支架复合材料需要一定强度、孔隙率等复杂结构，才能更加真实地模拟人体的微环境，本实验中的含钆化合物的羟基磷灰石材料满足了孔隙率及大孔径共存的三维立体结构，其对细胞增殖的能力值得期待。

本实验制备的含钆化合物的羟基磷灰石复合支架材料，其外观及电镜下已经具有很好的孔隙率及大孔径的三维立体微孔结构，但是其支架的细胞毒性及共培养后细胞增殖能力的影响，仍需要我们进一步深入研究。