王亚东 王俊峰

（1.芜湖市中医医院普外科，安徽 芜湖， 241000；2.安徽医科大学，安徽 合肥， 230032；3.皖南医学院弋矶山医院普外科，安徽 芜湖， 241001）

胰腺癌是全球七大常见癌症之一，在发达国家排名第三，是一种致命疾病，五年生存率仅为9%[1]。但由于缺乏早期特异性症状和晚期诊断，手术只对15%～20%的胰腺癌患者有较好的治疗效果，且近年来我国胰腺癌的发病率和病死率都在持续上升[2-3]。因此在分子水平开展对胰腺癌侵袭和转移机制的研究尤为重要。microRNA（miRNA）是近年来的研究热点RNA，其长度约为20～22 个核苷酸，属于小型的非编码RNA，其在转录后水平上调节基因的表达[4]。研究表明，miRNA 影响几种生物过程，其中包括细胞的发育、分化、增殖和凋亡，当表达失调时，这些过程的改变可能引发癌变[5]。miR-590-3p 属于真核翻译起始因子4H 基因的内含子之一，miR-590-3p 首次报道可增强心肌梗死后的心肌细胞增殖和心脏再生[6-7]。最近的研究报道miR-590-3p 对几种类型的癌症有影响，不过其在胰腺癌中的作用尚不清楚[8]。本研究将通过上调miR-590-3p 在胰腺癌Capan-2 细胞中的表达，探索并讨论其对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及转染

Capan-2（人胰腺癌细胞系）从中国科学院上海生命科学研究院中心购入，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基（Sigma）。细胞贴壁生长，用0.25%的胰酶消化传代。当Capan-2 细胞数量增至约为6×105时将其接种于6 孔板中，待细胞达到80%左右生长密度时，按照试剂说明书使用lipofectamine2 000 转染试剂进行细胞转染。根据是否转染将细胞分为阴性对照组（NC 组）以及转染miR-590-3p mimics 组（miR-590-3p mimics 组）。

1.2 逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

通过Trizol 试剂盒将细胞的总RNA 进行提取，再通过分光光度计检测RNA 的浓度和纯度，并将总RNA 逆转录为cDNA；miR-590-3p 正向引物5’-AGCCGGAGACTTACCCA ATTG-3’，反向引物：5’-GTCTCTCGACAGTTACTC-3’；GAPDH 为F: 5’-GCTCATCGGCCTCCATTCA-3’ , R:5’-TACGCGACGTCGGCGAGCTT-3’。将cDNA 作为模板，并根据试剂盒配置反应体系的说明在95℃下预热5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循环40 次）的反应条件下进行反应。最后miR-590-3p 的相对表达水平通过 2-ΔΔCT方法进行计算。

1.3 细胞凋亡实验

当Capan-2 细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶将其消化，并用冷藏保存的磷酸盐缓冲液（PBS）对细胞进行洗涤，根据Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒说明步骤，采用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。

1.4 细胞增殖实验

当Capan-2 细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶将其消化，悬浮细胞后调整细胞至合适的密度，以每孔90～100 μL 的液体量接种细胞悬液于96 孔板，分别在转染24 h、48 h、72 h时，加入10 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液到各孔中，在37 ℃的温度下孵育4 h 后弃掉上清夜，加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO）至各孔，最后进行摇床孵育。在490 nm 波长处检测各孔的吸光度（OD 值）。

1.5 细胞划痕实验

细胞转染后使用无血清培养基培养24 h，用20 μL 枪头进行划痕，将脱落的细胞洗涤。接着通过显微镜进行拍照，记录下划痕宽度并标记。最后放置于培养箱培育24 h 后同样在显微镜下进行拍照并标记划痕宽度。根据细胞愈合时的相对间距评估细胞运动能力。

1.6 细胞侵袭实验

当Capan-2 细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶将其消化，用少量不含胎牛血清的培养液将其悬液，并将90～100 μL细胞接种至Transwell 小室的上半室，并加入约400 μL 的培养基于下半室中。将其放置于5%CO2、37 ℃培养箱内培养24 h 后，用0.3%的结晶紫染液染色30 min，洗去残余染液，在显微镜下拍照并计数。

1.7 Western blot 实验

当Capan-2 细胞生长至对数期时，加入RIPA 细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白。采用BCA 试剂盒测量细胞样品的蛋白含量，取适量且等量的样品加入10% SDS-PAGE 凝胶的上样孔中，通过电泳法进行蛋白分离，电泳结束后将蛋白转移至NC 膜，通过5%脱脂牛奶在室温下将其封闭1.5 h。待封闭结束，在相应分子量对应条带位置进行裁剪，并分别加入1:1 000 浓度的AKT、p-AKT、mTOR 以及p-mTOR 一抗溶液，在4 ℃下孵育过夜，一抗孵育24 h 后取出条带用TBST洗涤3 次，10 min/次，洗涤结束后于室温条件下进行1 h二抗孵育，结束后用TBST 洗涤3 次，10 min/次，最后加入ECL 发光液于化学发光仪进行曝光，以GAPDH 为内参，通过Image Lab 软件对蛋白质表达量进行定量统计并分析。

1.8 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件对上述实验所得的所有数据进行分析。计量资料以（±s）表示，比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-590-3p 在胰腺癌细胞中表达情况

采用qRT-PCR 法检测人胰腺导管上皮hTERT-HPNE 细胞以及胰腺癌Capan-2 细胞中miR-590-3p 的表达。结果显示，miR-590-3p 表达量分别为（1.00±0.23）、（0.56±0.12）,差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 miR-590-3p 在胰腺癌细胞中表达情况 （±s）

表1 miR-590-3p 在胰腺癌细胞中表达情况 （±s）

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2.2 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞中miR-590-3p水平的表达

qRT-PCR 结果显示，miR-590-3p 在NC 组及miR-590-3p mimics 组mRNA 表达量分别为（1.00±0.15）、（4.23±0.32），miR-590-3p mimics 组miR-590-3p mRNA 水平较NC 组高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞中miR-590-3p 水平的表达 （±s）

表2 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞中miR-590-3p 水平的表达 （±s）

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2.3 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞凋亡能力的影响

细胞凋亡实验结果显示，NC 组以及miR-590-3p mimics组凋亡率分别为（15.64±1.82） %、（37.95±2.65） %。miR-590-3p mimics 组凋亡能力较NC 组表达显著增加，差异有统计学意义（t=12.020，P＜0.001），见图1。

图1 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞凋亡能力的影响

2.4 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞增殖能力的影响

MTT 增殖实验结果显示，Capan-2 细胞中NC 组及miR-590-3p mimics 组24 h、48 h、72 h 细胞增殖率分别为[（72.56±5.12）、（80.18±6.23）、（89.65±6.37）]%、[（52.15±5.02）、（56.34±5.62）、（62.15±5.84）]%。miR-590-3p mimics组增殖能力较NC 组表达显著降低，差异有统计学意义（t=-4.930，P=0.008 ；t=-4.921，P=0.008 ；t=-5.512，P=0.005）。

2.5 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，miR-590-3p mimics 组细胞迁移能力较NC 组明显减弱，表明过表达miR-590-3p 显著降低了Capan-2 细胞迁移能力，见图2。

图2 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞迁移能力的影响

2.6 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞侵袭能力的影响

Transwell 细胞侵袭实验结果显示，miR-590-3p mimics组细胞侵袭能力[（26.45±3.56）个]较NC 组[（57.25±4.52）个]明显减弱，差异有统计学意义（t=9.623，P＜0.001），见图3。

图3 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞侵袭能力的影响

2.7 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞AKT/mTOR 通路相关蛋白表达的影响

Western blot 实验结果显示,与NC 组相比，miR-590-3p mimics 组中p-AKT 和p-mTOR 蛋白水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；NC 组与miR-590-3p mimics 组中AKT 和mTOR 蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、图4。

图4 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞AKT/mTOR 通路相关蛋白表达的影响

表3 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞AKT/mTOR 通路相关蛋白表达的影响 （±s）

表3 上调miR-590-3p 对胰腺癌Capan-2 细胞AKT/mTOR 通路相关蛋白表达的影响 （±s）

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3 讨论

目前，胰腺癌仍然属于高度致命的恶性肿瘤，预计在未来三十年左右会成为全国癌症死亡的第二大病因[9]。据统计，大约85%的胰腺癌患者会出现转移，因此胰腺癌的五年生存率仅仅只有10%[10]。虽然胰腺癌的诊断方法、围手术期管理、放疗技术和晚期患者全身治疗获得了显著进展，但仍有20%的患者在手术后只能存活五年，这表明在分子水平上找到正确的治疗胰腺癌的靶点仍然是关键的。

近年的研究报道miR-590-3p 在各类型的癌症中发挥着重要作用，但其在胰腺癌中的作用尚未确定，一些研究报告了miR-590-3p 在其他类型的癌症中的肿瘤促进和肿瘤抑制作用。例如，miR-590-3p 通过抑制RB1 促进T 细胞急性淋巴细胞白血病的细胞增殖和侵袭，通过靶向Hippo 途径和促进β-连环蛋白信号传导促进结直肠癌的细胞增殖和侵袭[8-11]。同样，在胶质母细胞瘤中也观察到miR-590-3p 具有肿瘤促进作用[12]。另外，研究报道miR-590-3p 可抑制肝细胞癌生长并抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移[13-14]。本研究通过体外实验转染miR-590-3p mimics 到胰腺癌Capan-2 细胞系获得了miR-590-3p 过表达细胞系，发现miR-590-3p mimics转染组细胞中凋亡能力增加，细胞增殖、迁移、侵袭能力明显减弱，表明上调miR-590-3p 可以抑制胰腺癌肿瘤细胞的发生与发展。

P13K/AKT/mTOR 通路是一种细胞内信号传导通路，参与多个生物学过程，是细胞应激生存的关键调节因子。该通路的失调与多种人类疾病的进展有关，包括糖尿病、自身免疫性疾病和肿瘤[15]。由于肿瘤存在于内在应激环境中，该通路在癌症中的作用至关重要。P13K 是由调节亚基p85 和催化亚基p110 构成二聚体。当它与生长因子受体（如EGFR）结合后，可改变AKT 的蛋白结构并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相关蛋白的活性，从而调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等表型[16]。P13K/AKT下游靶点是mTOR，它接收并整合由营养摄入、生长因子和其他细胞刺激启动的信号，以调节下游信号和蛋白质合成，并通过其下游效应子参与启动核糖体翻译，将mRNA 转化为细胞生长、细胞周期进展和细胞代谢所必需的蛋白质[17]。由此可见，P13K/AKT/mTOR 通路的激活会导致对细胞生长和生存控制的严重干扰，最终导致竞争生长优势、转移能力、血管生成和治疗耐药性[18]。因此针对这一通路进行靶向治疗可以有效地抑制肿瘤的进一步发展。本研究中通过检测P13K/AKT/mTOR 通路相关蛋白的表达水平，探讨上调miR-590-3p 对胰腺癌细胞侵袭和转移的影响，结果显示miR-590-3p mimics转染组p-AKT 和p-mTOR 表达明显降低，表明上调miR-590-3p 可明显降低抑制AKT 与mTOR 的磷酸化，进一步抑制胰腺癌的进展。

综上所述，本研究以胰腺癌Capan-2 细胞为研究对象，证实了上调miR-590-3p 对胰腺癌细胞侵袭和转移能力具有明显抑制的作用， 其作用机制还需要深入研究。 以上研究进一步加深了miR-590-3p 在胰腺癌中的功能和分子机制的认识，为胰腺癌在临床的诊疗提供了一定的理论思路与依据。