左琴琴 张良子 吴大洲 张泳 褚晓月 张薇薇 王红 毛娟 徐华(陕西省血液中心，陕西 西安 710061)

截止2023 年3 月，国际输血协会(International Society of Blood Transfusion，ISBT)公布了45 个血型系统，共360 个抗原，ABO 血型系统作为第1 个被发现的血型系统，在临床输血医学中有着非常重要的作用[1]，因此ABO 血型的准确定型对于红细胞的相容性输血来说具有重要的临床意义[2-3]。目前，ABO 血型的血清学鉴定依然没有更好的替代方案，基因分型检测的只是能否表达相应酶的先决条件，有基因并不代表相应的抗原一定能够表达[4-7]，因为无论是合成A 抗原的N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶还是合成B 抗原的半乳糖转移酶，只有在H 底物存在且酶促反应条件具备的情况下才有可能正常表达相应的A、B 抗原，因此，对无可替代的血清学实验技术有必要做更加深入细致的研究。 本文就单克隆定型试剂及人源抗-A/B 在吸收放散试验中的应用进行对比评价，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象及标本来源 2015 年9 月—2023 年3 月期间西安地区的无偿献血者标本，29 名献血者均为汉族，排除了重复献血者。 献血者ABO 血型微孔板法初次筛查均显示正反定型不符，且同时使用了单克隆抗-A/B 及人源抗-A/B 进行吸收放散试验，最终确定了ABO 血型。 2022 年7 月至8月期间检测了西安地区512 名A 型及504 名B 型无偿献血者抗-A/B 效价。

1.2 试剂与仪器 正定型抗-AB 试剂(Rapid Labs Ltd，英国，BG-AB 10，批号:AB 0520-30)；抗-A/B 试剂(试剂1:上海血液生物，批号:20211218；试剂2:长春博德生物，批号:20220301；试剂3:Rapid Labs Ltd，英国，BC-A 10 和BC-B 10，批号:600144-B 2 和610168-H 2；)；反定型ABO 试剂红细胞(上海血液生物，批号:20235306)；人源抗-A/B，O 型红细胞(实验室自制)；DL 2000， 2X GC Buffer， LATaq酶，dNTP，6× Loading Buffer ( TaKaRa， 日 本， 批 号: AJG1333AA，AK7160A， AL14425A， AKF2422A， A6601A)；血液基因组DNA 提取试剂盒(Roche，德国，批号:11796828001)；台式离心机(KA-2200 型，日本久保田)；台式高速离心机(FL-3010，徽科方领)；台式低速离心机(FL-1008，徽科方领)；全自动红细胞洗涤离心机(MC 450，日本日立)；PCR 仪(Sensoquest Labcyle，德国)；水浴箱(GFL，德国)。

1.3 方法

1.3.1 血清学试验 按照文献方法[8-9]，采用试管法同时使用3 个厂家的单克隆试剂进行ABO 血型血清学正反定型试验；吸收放散试验使用试剂1(上海血液生物)及人源抗-A/B 血清，按照文献方法[10]同时进行。

1.3.2 献血者人群中抗-A/B 效价检测 按照文献方法[9]，采用试管法将血清倍比稀释后检测西安地区B/A 型献血者人群中抗-A/B 的效价，最终以肉眼可见凝集强度1＋的最高稀释度的倒数表示。

1.3.3 DNA 制备 按照Roche DNA 提取试剂盒说明书，从5 mL EDTA-K2抗凝外周血标本中提取基因组DNA，用于标本的ABO 基因检测。

1.3.4 基因分型方法 ABO 基因Exon 6，7 特异性扩增测序所有样本，按照文献方法[11]进行操作，无法确定样本ABO基因型时对Exon1-7 同时扩增确定其基因型。 试验中使用扩增引物[11]的合成及扩增产物的测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司西安测序部完成。

1.3.5 统计分析 使用SPSS 22.0 软件，用描述性统计方法分析献血者人群中抗-A/B 效价的分布。

2 结果

2.1 西安地区献血者人群中抗-A/B 效价分布 献血人群中人源抗-A 效价95%置信区间上限为59.29，众数为64；人源抗-B 效价95%置信区间上限为62.10，众数为128。 故本研究吸收放散试验中所使用的人源抗体选择4～6 人份且效价为64 的献血者血浆进行试验(表1)。

表1 人源抗-A/B 在献血者人群中的效价分布

2.2 单克隆试剂与人源抗-A/B 特异性的比较 3 种单克隆抗-A/B 定型试剂与人源抗-A/B 对A、B、O 和AB 4 种表型(各型数量n＝3)红细胞在4℃10 min、室温、37℃10 min 条件下反应的特异性见表2(3 种单克隆试剂结果一致)，试验中人源抗-A/B 的效价均为64，4 种血型表型对应的基因型分别为ABO*A1.01/O.01.01，ABO*B.01/O.01.01，ABO*O.01.01/O.01.和ABO*A1.01/B.01。 在此试验中，3 种单克隆抗-A/B 定型试剂与各标本在4℃10 min、室温、37℃10 min条件下反应强度均为4＋，而人源抗-A/B 与各标本在4℃10 min 及室温条件下反应强度均为4＋，但在37℃10 min 反应后强度变弱为1＋s。

表2 单克隆试剂与人源抗-A/B 特异性的比较

2.3 单克隆试剂与人源抗-A/B 亲和力的比较 3 种单克隆抗-A/B 定型试剂、效价稀释到64 的3 种单克隆定型试剂及人源抗-A/B 与A1/B 细胞反应的抗体效价、出现凝集时间及凝集强度的检测结果见表3，人源抗-A/B 选择效价64 的献血者(n＝3)。 人源抗体出现凝集的时间为40 s，与效价稀释到64 的单克隆定型试剂相比，出现凝集的时间较长，凝集强度也较弱(1＋)。

2.4 ABO 血型鉴定中人源抗体在吸收放散试验的应用 对29 例ABO 正反定型不符的标本，采用试管法分别进行正、反定型的检测，使用3 个厂家的单克隆抗-A/B 定型试剂同时进行正定型的检测。 吸收放散试验使用试剂1(上海血液生物)及人源抗-A/B 血清同时进行；各标本基因测序结果以ABO*A1.01 等位基因(GenBank No:NG_006669.1)为参考序列进行比对，结果见表4。 3 号标本(ABO*AEL.02/O.01.01)单克隆抗体及人源抗体均未检出A 抗原；2 号(ABO*AEL.02/O.01.01)，16 号(ABO*BEL.03/O.01.01)及25 号标本(ABO*A1.02/BEL.11)单克隆抗体检出A/B 抗原，而人源抗体均未检出A/B 抗原；29 号标本(ABO*A1.02/A1.02)单克隆抗体检出B 抗原，而人源抗体未检出，此种结果出现的原因可能为单克隆抗体间的交叉反应性引起。 29 个标本中未发现人源抗体检出A/B 抗原，单克隆抗体未检出A/B 抗原。

表4 单克隆试剂及人源抗-A/B 检出能力的比较

3 讨论

ABO 血型系统为临床输血医学中最为重要的血型系统，ABO 血型正反定型的准确性是红细胞相容性输血的基本前提。 ABO 血型系统中A 和B 抗原是在H 抗原的基础上通过糖基转移酶的催化作用形成的，通过其与抗-A/B 反应的凝集强度加以区分和鉴别[12]。

吸收放散试验是鉴定ABO 弱表现型(亚型)的重要的血清学试验[13]，故ABO 血型血清学的鉴定中就需要注意吸收放散试验的使用以及试验中吸收用抗体的选择。 本研究对29 例ABO 正反定型不符并且需要通过吸收放散试验确定ABO 血型的标本进行研究，比较分析了3 种单克隆定型试剂及人源抗-A/B 的特异性、亲和力以及在吸收放散试验中对弱抗原的检出能力。 从试验表现看，人源抗-A/B 在37℃反应的凝集强度较低，同时与效价稀释到64 的单克隆定型试剂＋对应红细胞反应相比较，出现凝集的时间较长，凝集强度也较弱，亲和力较低，其原因可能是人源抗体针对特定表位的抗体浓度低。 吸收放散试验中，3 号标本单克隆试剂及人源抗体均未检出A 抗原；2，16 及25 号标本单克隆试剂检出A/B 抗原，而人源抗体均未检出A/B 抗原；其余标本单克隆试剂及人源抗体均同时检出A/B 抗原，但是人源抗体的凝集强度相对较弱。 29 个标本中未发现单克隆抗体未检出A/B 抗原，而人源抗体检出A/B 抗原的情况。

单克隆抗体是采用杂交瘤技术由1 个仅识别1 种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，其特异性强，纯度高[14]。 通常，鉴定A/B 抗原的市售抗体均为针对某一抗原表位的单克隆抗体，具有亲和力和敏感性好的优点。 但是，单克隆抗体也存在一定的缺陷，当标本抗原上缺失单克隆抗体对应的表位时，就可能产生阴性的反应结果[15]。 由于ABO 抗原的复杂性，在ABO 弱表现型(亚型)的鉴定中，就会出现某一厂家血型定型试剂鉴定结果阴性，而另一厂家血型定型试剂结果阳性的问题，我们曾报道了不同厂家血型单克隆定型试剂在ABO 弱表现型(亚型)鉴定结果的差异性[15]。此外，如果当单克隆抗体针对的A 抗原的某些表位和B 抗原共有时，针对A 抗原的抗体也会和B 抗原发生反应，反之亦会出现，这种现象即为抗体的交叉反应性，在某些情况下可以造成结果的误判[13]，如本研究中的29 号标本(ABO*A1.02/A1.02)经单克隆抗体进行吸收放散试验后，检测出红细胞上存在B 抗原，而人源抗体未检出。 鉴于此，人源抗-A/B作为多克隆抗体，理论上可覆盖较多的A/B 抗原表位，能捕捉到ABO 弱表现型(亚型)上的表位，但人源抗-A/B 也存在较大的缺陷，主要是抗体浓度低、亲和力低，同样会出现假阴性的结果，因此在鉴定ABO 弱表现型(亚型)的试验中，更多应用于吸收放散等敏感性较高的血清学试验。

综上所述，ABO 血型鉴定中，单克隆抗-A/B 和人源抗-A/B 抗体在吸收放散试验中有不同的反应特性和结果。 需要提示的是，在血清学试验中，只有依据各种方法、试剂的特点，合理选择使用的试剂，同时合理采用相应的方法学，才能得出准确的结果，确保输血安全。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。