代 兄 ,张惠洁

(1.内蒙古医科大学第三临床医学院,内蒙古 包头 014010; 2.内蒙古包钢医院肿瘤内科)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,在人群中的发病率及病死率逐渐上升。由于早期症状不明显,病情进展较快,85 %以上的CRC发现时即为中晚期,即使经过手术、放化疗、靶向治疗等综合治疗,患者5年生存率仍低于40 %[1]。近年来,通过对CRC发病机制的不断探索,多项研究[1]已证实肿瘤免疫逃逸与CRC的发生、发展有密切关系。免疫治疗通过增强机体的免疫力,从而提高免疫系统识别、监视和清除肿瘤的能力,有望成为抗肿瘤治疗的主要方法。肿瘤免疫应答时,T细胞是抗击肿瘤的关键因素,它们的完全活化除取决于抗原刺激信号外,还需共刺激信号的参与。正向共刺激分子和负向共抑制分子均表达于T细胞的表面,其抑制性分子称之为免疫检查点[2]。程序性死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1v-1,PD-L1)、细胞毒T 淋巴细胞相关蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、淋巴细胞激活蛋白3(lymphocyte activation gene-3, LAG3)等负向调控免疫应答,均属于抑制T细胞免疫的检查点蛋白,参与免疫逃逸[3]。美国食品药品监督管理局于2017年批准免疫检查点抑制剂(ICIs)用于治疗MSI-H/dMMR型晚期CRC,而最新的KEYNOTE-177研究表明[4],帕博利珠单抗可以显著改善mCRC患者的中位无进展生存期(mPFS)、客观缓解率(ORR)及毒性,免疫治疗后这些指标均优于传统的化疗方案。尽管由于用药交叉等原因帕博利珠单抗在总生存期(OS)方面的表现未能显著优于化疗方案,但目前的结果支持帕博利珠单抗作为MSI-H/dMMR mCRC患者的一线治疗药物。虽然ICIs在CRC中已经显示出一定的治疗前景,但是其效果因患者而异。同期研究显示,ICIs 在 DNA 错配修复正常(proficiency of mismatch repair, PMMR) 、微卫星稳定 (microsatellite stability, MSS) 或微卫星低度不稳定(microsatellite instability-low, MSI-L)的mCRC中效果甚微,甚至无效[1]。此外,ICIs在dMMR /MSI-H 型mCRC中客观有效率只有30 %～40 % ,且在疾病好转后,仍会出现再次的进展,即对 ICIs 存在耐药问题[5]。TME是指肿瘤得以发生、发展的土壤,包括内环境、外环境。许多研究显示,TME通过各种机制参与促进CRC的发生、发展、免疫抑制和炎性反应,为介导CRC耐药提供有利条件。为了找到CRC患者免疫耐药的机制,笔者从TME方面相关机制综述如下。

随着研究的深入,越来越多的证据表明,CRC的发生和发展是由于肿瘤微环境中细胞之间复杂的相互作用所导致的遗传和表观遗传变异所致。这种多基因、多因素、多分子信号参与的恶性积累过程,是导致CRC发病的重要机制。人体内部正常组织周围的微环境是抵御肿瘤的重要防线,它能够有效地阻止肿瘤的生长。肿瘤细胞可以通过募集肿瘤相关成纤维细胞、调控免疫细胞及其分泌因子、调控免疫系统及血管内皮细胞生长等方式来改变周围的微环境,从而形成TME。TME是一种乏氧、低pH、慢性炎症、免疫抑制及代谢异常的微环境,通过彼此的相互作用、相互促进,参与肿瘤发生发展及免疫耐药性的产生。CRC患者对 ICIs 产生耐药的相关机制将从以下几个方面来论述。

1 耐药机制

1.1肿瘤免疫原性改变 肿瘤抗原是肿瘤发生、发展过程中出现的过度表达的抗原物质,也是免疫系统识别癌细胞的靶点,这对于 ICIs 的抗肿瘤效果尤其重要。高肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)经常伴随新抗原的释放, 在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用[6]。Giannakis 等[7]对179例CRC患者肿瘤样本的分子特征进行研究,发现与pMMR-MSI-L型mCRC相比,dMMR/MSI-H型mCRC有更高的基因突变率, TMB更高。这就说明 TMB越高,采用PD-1/PDL-1抑制剂治疗的效果越好。既往KEYNOTE-016[5]及 CheckMate-142[8]二线队列研究结果均显示 PD-1 单抗单药治疗 MSI-H型mCRC患者的疗效约在 30 %～40 %,提示存在原发免疫耐药,需要进一步细分和甄别MSI-H人群,寻找有效生物标志物。经过对22例 MSI-H mCRC型患者的研究发现[9],TMB水平可以较强地预测ICIs的治疗效果,即高TMB的13例患者均获得客观缓解,而低 TMB的9例患者中有6例患者疾病进展,TMB不同的两组患者的mPFS分别是未达到和2个月。这些研究进一步提示,将dMMR/MSI-H 表型与TMB、肿瘤新抗原、 MSI 的程度等多种因素综合考虑,根据ICIs治疗的不同敏感性划分,将会成为未来研究的重要热点。

1.2免疫细胞

1.2.1肿瘤浸润性淋巴细胞 肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)是指存在于肿瘤微环境内的以T细胞为主的一类异质性淋巴细胞群体。TILs主要由T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和髓系来源抑制细胞等组成,以T细胞成分为主。CD4+T 细胞主要分为Th细胞和Tr细胞。Th细胞又可分化为Th1、Th2等免疫细胞,Th细胞正常情况下通过分泌多种炎症因子促进 B细胞、CD8+T 细胞及吞噬细胞等其他免疫细胞的功能[10]。有研究发现,在 MSI-H/dMMR型CRC中CD4、CD8、Th1细胞相关基因(TBX21)、PD-L1的表达显著高于pMMR-MSI-L CRC,在MSI-H/dMMR型CRC中,TBX21和PD-L1的表达呈正相关[11],且 TBX21+PD-L1-、TBX21+PD-L1+的CRC患者总生存期更长,这提示MSI-H/dMMR型CRC患者高表达TILs ,其抗肿瘤效应较高,肿瘤微环境更加活跃,更适合免疫治疗。而MSS/PMMR等亚型的CRC患者TILs表达较低,对免疫治疗效果不及MSI-H/dMMR型CRC患者,甚至产生免疫耐药。

1.2.2髓源抑制性细胞 髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一类病理状态下(如肿瘤)增殖和活化并具有免疫抑制能力的异质性的髓细胞群,包含巨噬细胞、幼稚粒细胞、早期骨髓细胞及不同分化阶段的树突状细胞[12]。免疫抑制微环境在肿瘤的发生发展中起到重要的驱动作用,其中,MDSCs 作为主要的抑制性免疫细胞群之一,对结直肠癌的发生发展起到关键作用。在CRC患者中,MDSCs 抑制细胞毒性T细胞功能的效应分子包括精氨酸酶1和氧化亚氮[13]。 在小鼠结直肠癌移植瘤模型中,MDSCs高表达的缺氧诱导因子 1α( HIF-1α) 可以诱导精氨酸酶 1 和T细胞活化的 V 域 Ig 抑制因子上调,还可以产生诱导型氧化亚氮合酶,促进 MDSCs介导的T细胞抑制[14]。MDSCs 通过多种途径,如限制半胱氨酸的合成、精氨酸的分解、分泌免疫抑制因子(如TGF-β1)的分泌以及 VEGF 的表达来强烈抑制效应性T细胞和自然杀伤细胞的活性,并激活Tregs,从而介导免疫耐药性,达到抗肿瘤的目的[14-15]。

1.2.3肿瘤相关巨噬细胞 肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAMs)是外周血单核细胞浸润到实体肿瘤组织中而演变成的巨噬细胞,肿瘤的基质细胞中占很大的比例,是TME中重要的免疫细胞,可分泌多种蛋白酶、趋化因子、细胞因子等,促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移[16]。在TME 中,巨噬细胞在成熟分化过程中表现出两种不同的激活状态:经典活化型(M1型)和替代活化型(M2型),其中M2型TAMs 在肿瘤免疫耐药和疾病进展中发挥着重要作用,它们可以显著降低患者的总生存期,并且可能会导致不良的预后[17]。研究表明,M2型TAMs在TME中分泌的细胞因子、趋化因子、酶能刺激诱导Treg的产生,甚至可以募集天然的调节性 T 细胞,这两种细胞都能够发挥免疫抑制的作用,从而导致结直肠癌免疫耐药[18]。TAMs 还可以通过募集其表面的 Fc 段受体,与抗 PD-1 抗体竞争性结合,导致免疫耐药[19]。

1.3Wnt信号通路异常 Wnt/β-catenin信号通路在哺乳动物的许多生理过程中都扮演着至关重要的角色,而其异常激活可能会导致结直肠癌的发生和发展。 在小鼠模型中研究发现,β-catenin的高表达与肿瘤微环境CD103+树突状细胞降低存在关联。其原因是Wnt/β-catenin信号通路诱导转录抑制因子AFT3的表达,AFT3明显抑制CCL4基因的表达,CCL4是典型的一种CD103+树突状细胞的趋化因子,从而导致CD103+树突状细胞浸润减少。因此,当抗原提呈细胞缺乏时,初始T细胞活化受阻,浸润性T细胞减少,最终影响免疫应答[20]。经过1 000多例结肠癌患者的单细胞测序研究发现,85 %MSI-H型CRC患者无法获得免疫治疗,这是由Wnt/β-catenin信号通路的异常传导所致[29]。当Wnt/β-catenin信号通路被激活时,结肠癌中的免疫细胞数量会显著减少,这也就意味着Wnt信号通路与T细胞浸润之间存在负相关性[12]。以上表明Wnt/β-catenin信号通路负性调节免疫检查点抑制剂的疗效,从而导致了免疫耐药。

1.4缺氧微环境 肿瘤微环境的主要特点是缺氧或氧利用减少,使多种缺氧蛋白出现基因变化,从而导致肿瘤发生。这一过程主要通过缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF) 起作用,而HIF-1α不仅促进免疫相关细胞表达PD-L1,还通过增加TME中的腺苷促进免疫抑制环境的形成[21]。在缺氧环境下细胞外ATP明显增多,并被CD39迅速代谢为ADP、AMP,随后CD73致使AMP去磷酸化转变成腺苷[22]。由此聚积的腺苷与腺苷受体 A1R、A2AR、A2BR和A3R结合后抑制了T细胞和NK细胞的效应,而且与免疫相关细胞相互作用诱导强烈的免疫抑制作用[22-23]。因此,靶向参与ATP降解的酶和腺苷受体,以及HIF(主要是HIF-1α和 HIF-2α)抑制剂可能成为提高ICIs疗效的策略[22]。Tang等[24]研究还显示,在缺氧条件下,癌症相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)通过转化生长因子和 HIF-1α 的协同作用,可诱导结直肠癌的免疫治疗耐药。

1.5炎症微环境 炎症是组成肿瘤微环境的重要部分,与肿瘤的发生与发展有密切关系。研究发现,持续地暴露于肿瘤抗原和炎症环境中,T细胞抑制性受体激活,效应因子缺失,致使其杀伤肿瘤细胞功能受损,从而形成抑制性的免疫微环境,导致免疫耐药[25]。近年研究表明,炎性细胞因子与CRC发生发展密切相关,其中比较常见的有肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)、白细胞介素 6(interleukin 6 ,IL-6)、转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)等细胞因子,在肿瘤细胞中,TGF-β可以诱导β-catenin的表达,从而转录调控寡糖基转移酶复合物催化亚基 STT3 表达上调,促进PD-L1糖基化的增强,稳定PD-L1蛋白的膜表达水平,促进肿瘤细胞免疫逃逸[26]。

1.6肿瘤代谢 在肿瘤进展过程中,肿瘤细胞通过代谢特征变化来满足肿瘤微环境的稳态和快速生长的需求。Vasaikar等[27]进行的一项蛋白基因组学研究,探索了dMMR/MSI-H型mCRC的代谢,与其他亚型相比,蛋白质谱分析显示MSI-H亚型CRC患者的糖酵解酶广泛增加,而糖酵解与CD8+T细胞浸润数量之间存在负相关,提示肿瘤细胞通过增加糖酵解来产生过多的乳酸,而乳酸是Warburg效应的关键产物,是CD8+T细胞的强效抑制剂。结果说明随着肿瘤患者糖酵解增多,其乳酸的产生也会相应增多,而乳酸可以损害肿瘤微环境中T细胞的功能,可导致CRC患者的免疫治疗耐药。因此,可以考虑抑制肿瘤患者的糖酵解来克服MSI-H型CRC对免疫检查点阻断的抵抗力。

2 免疫耐药的应对策略

2.1将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤” 所谓冷肿瘤是指肿瘤微环境中浸润性免疫细胞少,或免疫细胞难以渗透。相反地,热肿瘤是指肿瘤微环境中有很多如T淋巴细胞等的抗肿瘤免疫细胞浸润。冷肿瘤免疫细胞浸润不足的最主要原因是肿瘤抗原低表达,促进肿瘤相关抗原暴露为有效的解决途径。免疫联合化疗或者免疫耐药后再予化疗,过一段时间再使用免疫治疗,不仅可以增加树突细胞的交叉呈递抗原作用,也可以弱化肿瘤微环境的免疫抑制成分[28-29]。

2.2双免疫治疗 双免联合使用可起到1+1>2的作用,其中最为常见的双免治疗为PD-1抑制剂联合抗CTLA-4抗体,其可能原因是两者作用机理不同。CheckMate-142[8]研究旨在探讨MSI-H型mCRC患者的双重免疫治疗策略,这项研究比较了纳武利尤单抗及纳武利尤单抗联合应用伊匹木单抗治疗MSI-H型mCRC,研究发现双免治疗的ORR效果比仅采用一种免疫疗法更好。

2.3免疫联合靶向治疗 通过靶向治疗,能够明显看出肿瘤抗原暴露的增多,并且能够与免疫治疗相互配合,从而有效地激活T细胞的活性。而通过抗血管生成药物的帮助,能明显实现血管的正常化,降低免疫抑制性细胞活性,改变肿瘤微环境,从而达到治疗的目的[30]。

2.4个体化免疫治疗策略 通过分析肿瘤免疫微环境的组成特点,我们可以根据肿瘤细胞新抗原的产生、T细胞活化、局部抑制性微环境解除等特点开发出一系列根据患者个人情况进行的免疫治疗,如溶瘤病毒、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞治疗等。或许如同Provenge[31]一样,CRC患者也可以尝试这种自体免疫治疗法,这种治疗方法可以通过注射肿瘤抗原负载的树突状细胞进入体内产生主动免疫应答,增强机体对肿瘤抗原的处理能力,并激活免疫应答,从而达到治疗肿瘤并预防复发的目的。

3 结论

ICIs在部分CRC患者中获得了临床疗效,可以有效延长患者的总生存期,但其耐药性也限制了ICIs的疗效与应用。有大量研究表明,肿瘤免疫耐药的产生与肿瘤细胞所处的微环境密切相关。在免疫治疗中,TME的重要作用日渐凸显。以上论述表明,肿瘤微环境中的多种细胞,如肿瘤细胞、免疫细胞、炎性细胞,以及脉管系统、癌细胞所处的特殊的乏氧、低pH、代谢异常的微环境均在肿瘤耐药的过程中起到了十分重要的作用。毫无疑问,在过去的几年中,CRC免疫治疗也取得了长足的进步,基于KEYNOTE-177令人信服的数据,FDA于2020年批准帕博利珠单抗静脉输注用于不可切除或MSI-H/dMMR mCRC患者的一线治疗,并且不需要同时与化疗联用。2021年6月帕博利珠单抗正式获得我国药监局批准,用于KRAS、NRAS、BRAF基因均为野生型,不可切除或MSI-H/dMMR mCRC患者的一线治疗,开启了国内CRC免疫治疗新时代。然而,真正的关键挑战是找到克服绝大多数pMMR-MSI-L mCRC患者免疫治疗原发性耐药的方法。与dMMR-MSI-H型CRC不同,占所有mCRC病例95 %的pMMR-MSI-L型mCRC具有低得多的TMB和免疫细胞的不良募集,导致对ICIS反应较差。为调节抑制性免疫微环境并改善免疫治疗效果,很多研究尝试了各种基于ICIs的策略,例如刺激肿瘤免疫和增强抗肿瘤活性的替代尝试,包括过继细胞治疗和癌症疫苗是积极研究的有希望的领域。当然,寻找敏感且特异性的生物标志物也是免疫治疗的必然趋势,这些问题尚有待继续探讨和进一步明确。相信随着临床工作者探索的不断深入,未来越来越多的患者将会从免疫治疗中获益。