王寿富 黎桃敏 张兰兰 钟志奎 施文婷 刘权震 魏 梅

广东一方制药有限公司广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244

丹参主产地为河北、陕西、山东等，其基源是唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhizaBge.），取其干燥根和根茎入药，其味苦，性微寒，可具有活血祛瘀、通经止痛等，常用于胸痹心痛、痛经经闭等病症[1-2]。丹参是我国常用的大宗药材，其发挥主要药效的关键成分为丹参所富含水溶性的酚酸类以及脂溶性的丹参酮类化合物，对血液及心血管系统有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抑制心肌纤维化等作用[2-5]。

2021年发布的《关于结束中药配方颗粒试点工作的公告》（2021年第22号）明确将中药配方颗粒的质量监管纳入中药饮片管理范畴，凸显了中药饮片的主体性，也表明在临床应用上中药配方颗粒是中药饮片的补充[6]。本研究利用HPLC法测定丹参饮片、水煎液、配方颗粒的指纹图谱[7]，对丹参饮片到水煎液再到配方颗粒制备全过程的质量相关性进行探究，以期为丹参配方颗粒的生产全过程质量控制和生产试验提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

试验用仪器见表1。

表1 试验所用仪器明细

1.2 试药

试验用试药见表2，其中17批丹参药材均为正品，可供本试验研究使用，药材鉴定员为广东一方制药有限公司魏梅主任药师；对应的饮片（编号Y1～Y17）、水煎液（编号S1～S17）和配方颗粒（编号K1～K17）均按照相关要求规定的方法制备而来。

表2 试验所用试药明细

2 方法与结果

2.1 色谱条件[8]

采用Waters Xselect HSS T3色谱柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5.0 μm）；采用双相流动相系统按表3进行梯度洗脱；体积流量为1.0 ml/min；检测波长为286 nm，进样量为10 μl。

表3 梯度洗脱表

2.2 标准品溶液的制备[8]

精密称取各对照品适量，加入甲醇水溶液（甲醇体积占比为80%）制成含丹参素19.992 μg/ml、原儿茶醛18.426 μg/ml、咖啡酸18.943 μg/ml、丹酚酸E 21.462 μg/ml、迷迭香酸21.288 μg/ml、紫草酸143.374 μg/ml和丹酚酸B 103.169 μg/ml的混合标准品溶液。

2.3 供试液的制备

2.3.1 丹参饮片供试液[8]取丹参饮片进行粉碎处理，粉末过三号筛，取过筛后粉末约0.2 g，精密称定，加甲醇水溶液（甲醇体积占比为80%）50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率为140 W、频率为42 kHz）30 min，取出，静置至样品冷却至室温，再次称定重量，用甲醇水溶液（甲醇体积占比为80%）补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得丹参饮片供试液。

2.3.2 丹参水煎液供试液[8]精密吸取丹参水煎液10 ml，再加甲醇溶液40 ml，照“2.3.1”项下制备方法，自“密塞，称定重量”起，同法制备，即得水煎液供试液。

2.3.3 丹参配方颗粒供试液[8]取丹参配方颗粒约0.2 g，研细，精密称定，按照“2.3.1”项下制备方法，自“加甲醇水溶液（甲醇体积占比为80%）50 ml”起，同法制备，即得配方颗粒供试液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验[9]取空白溶剂、混合标准品溶液及样品供试液适量，依法测定，记录谱图，见图1。在相应的保留时间处，样品供试液与混合标准品溶液色谱均被洗脱出相同的色谱峰，且空白溶剂对各成分的出峰无干扰，表明该方法具有良好的专属性。

图1 专属性试验HPLC色谱堆叠图

2.4.2 精密度试验[10]取“2.2”项下混合标准品溶液连续进样6次，依法测定，计算得各特征峰峰面积的RSD值均＜3%，表明试验所用仪器具有良好的精密度。

2.4.3 重复性试验[11]按“2.3”项下方法，取同一份配方颗粒制备6份样品供试液，依法测定，计算得各特征峰峰面积的RSD值均＜3%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.4 稳定性试验[12]按“2.3”项下方法制备丹参配方颗粒供试液，分别在得到样品供试液的第0、2、4、8、12、24 h依法测定，计算得各特征峰峰面积的RSD值均＜3%，表明样品供试液在24 h内稳定可测。

2.5 HPLC指纹图谱的确立与相似度评价

2.5.1 指纹图谱的确立[13]中药指纹图谱所包含的化学信息更加全面，更能准确反映中药内在质量[14]。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）和Origin 2018软件，将采集到的丹参饮片、丹参水煎液及丹参配方颗粒的指纹图谱进行叠加，形成共有模式，并建立对照指纹图谱R1、R2、R3，见图2～4。17批丹参饮片、水煎液及配方颗粒的指纹图谱均标记出8个共有特征峰，通过与对照品图谱比对，确定1号峰为丹参素、2号峰为原儿茶醛、3号峰为咖啡酸、4号峰为丹酚酸E、5号峰为迷迭香酸、6号峰为紫草酸、7号峰为丹酚酸B。

图2 17批丹参饮片的HPLC指纹图谱

图3 17批丹参水煎液的HPLC指纹图谱

图4 17批丹参配方颗粒的HPLC指纹图谱

2.5.2 相似度评价[13]采用多点校正法和Mark峰匹配，分别计算各批次饮片、水煎液、配方颗粒HPLC指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度。结果见表4，17批丹参饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度及丹参饮片-水煎液、饮片-配方颗粒、水煎液-配方颗粒间的相似度均大于0.990，表明不同批次丹参饮片、水煎液、配方颗粒的化学成分较为一致、质量较为稳定，丹参饮片到水煎液再到配方颗粒的生产工艺稳定，主要化学成分无丢失。

表4 丹参饮片、水煎液及其配方颗粒HPLC指纹图谱相似度评价结果

2.6 化学模式识别

化学模式识别作为一种统计分析手段，是化学计量学的重要组成部分，可以将原始数据集中差异性信息提取并分类[15-17]，如聚类分析法、主成分分析法、偏最小二乘法等是化学模式识别中较为常见的集中分析方法，在中药指纹图谱数据分析中得到了较为广泛的应用[15-16]。

2.6.1 Pearson相关性分析[7]以17批丹参饮片、水煎液、配方颗粒共51个样品“各特征峰峰面积与特征峰总面积的比值”为变量，通过SPSS 20.0软件进行Pearson相关分析，结果详见表5。丹参饮片与水煎液相比较，有4个共有特征峰呈现极显著的正相关性；丹参饮片与配方颗粒相比较，有4个共有特征峰呈现极显著的正相关性，1个共有特征峰呈显著正相关性；丹参水煎液与配方颗粒比较，8个共有峰均具有极显著的正相关性，说明丹参配方颗粒与水煎液之间可以进行较稳定的质量传递。

表5 丹参HPLC指纹图谱共有峰的相关性分析结果（r值）

2.6.2 聚类分析[18]以8个共有特征峰的“各特征峰峰面积与特征峰总面积的比值”为变量，利用SPSS 20.0统计学软件对17批丹参饮片、水煎液、配方颗粒进行聚类分析，结果见图5，当平方Euclidean距离为15时，除Y4外，其余饮片单独聚为一类，水煎液和配方颗粒另聚为一类，说明配方颗粒与水煎液质量较为一致。

图5 丹参HPLC指纹图谱聚类分析（CA）树状图

2.6.3 主成分分析[18]以“各特征峰峰面积与特征峰总面积的比值”值为变量，利用SPSS 20.0软件，对17批饮片、水煎液、配方颗粒的8个共有特征峰进行主成分分析，结果见表6、7及图6。以特征值＞1为提取标准[19]，提取出前2个主成分，其总方差的累积贡献率达89.33%，表明提取的2个主成分基本能反映全部指标的信息，其中主成分1载荷高的成分对饮片、水煎液和配方颗粒质量的影响最大。由主成分得分图可以看出水煎液与配方颗粒质量更为接近，这与聚类分析结果一致。

图6 丹参HPLC指纹图谱主成分得分图

表6 丹参HPLC指纹图谱主成分分析结果

表7 丹参HPLC指纹图谱主成分因子载荷矩阵

2.6.4 偏最小二乘法（PLS）分析[20-21]PLS分析是一种多元数据分析方法，在中药指纹图谱研究领域得到了广泛应用[20-21]。为进一步筛选影响分类的标志物，以17批丹参饮片、水煎液、配方颗粒的分类作为因变量（Y），8个共有峰峰面积占比作为自变量（X）；采用软件SIMCA 14.1软件进行PLS回归分析。由表8可知该模型预测能力较好。根据图7可知，前6个色谱峰的VIP贡献值＞1，说明丹酚酸E、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8对于饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱分类具有重要作用，而紫草酸及迷迭香酸的影响作用相对较小。

图7 丹参HPLC指纹图谱分类影响因素VIP得分图

表8 丹参HPLC指纹图谱分类的PLS回归精度分析

3 讨论

本研究通过HPLC法建立了丹参饮片、水煎液及配方颗粒的指纹图谱，并结合化学模式识别对丹参饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱信息进行了对比分析。相似度评价结果显示，饮片、水煎液、配方颗粒对照指纹图谱间的相似度均大于0.990，表明三者的化学成分基本一致，其主要成分可进行稳定传递。Pearson相关分析、聚类分析、主成分分析均显示水煎液与配方颗粒的内在质量更为接近，这与“中药配方颗粒与其相对应的单味中药饮片临床汤剂基本一致”的要求相符合[22-23]。PLS回归分析结果表明，影响指纹图谱信息分类的标志性成分主要是丹酚酸E、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8，以上确认的5种化学成分均为水溶性的丹酚酸类化合物，可发挥凉血消痈、清心除烦的功效[24-25]，对丹参配方颗粒质量控制有重要作用。

综上，本研究从饮片、水煎液、配方颗粒三者的关联性方面进行研究，反映了丹参饮片、水煎液、配方颗粒之间的质量相关性，可作为丹参配方颗粒生产过程的质量控制的数据参考。