陈红岩 陈英 陈梅根 李华

肺癌目前仍然是发病率、死亡率最高的恶性肿瘤, 随着肺癌发生逐年增加, 肺癌脑膜转移患者近年呈现明显增高趋势［1］。据文献报道［2］约有15%肺癌患者会出现脑膜转移。脑膜转移癌又称为脑膜癌病变,多是由于原发癌灶中的肿瘤细胞在脑膜、脊髓蛛网膜下间隙局灶性浸润或弥漫性扩散而致病。有数据显示［3,4］, 肺癌继发脑膜转移患者若不接受治疗, 其中位生存时间只有4～6 周, 若接受综合治疗生存期可能会延迟到3～5 个月, 最长达3 年以上。早诊断、早干预对本病预后改善有积极的作用。在临床上诊断脑膜转移的方法主要有磁共振成像(MRI)增强扫描、脑脊液细胞学检测, 其中脑脊液细胞学检测为诊断的“金标准”［5］。近年有研究报道显示［6］, 造成肺癌脑膜转移的因素较多, 如机体的免疫功能、血脑屏障损伤等,其中与肿瘤细胞整合素活性度有极大的关系。整合素β1是介导细胞与细胞外基质粘附的重要分子, 可影响肿瘤细胞增殖分化与迁移、侵袭［7］。目前已有研究指出［8］, 整合素β1可促使脑神经胶质瘤细胞在细胞外基质中粘附、迁移、侵袭, 但其在肺癌脑膜转移中的表达及其诊断价值相关研究较少见。为深入探讨肺癌脑膜转移肿瘤细胞整合素β1活性程度及其临床应用价值, 现将近2 年来肺癌脑膜转移患者30 例与脑部非肿瘤疾病患者30 例进行腰穿脑脊液癌细胞整合素β1活性程度检测, 结果分析报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1 月～2022 年12 月福建省市三级医院神经内科、外科、肿瘤科、呼吸内科及重症监护室(ICU)等临床确诊为“肺癌”且经多周期化疗、放疗及综合治疗的住院患者并经脑脊液细胞学检测确诊为肺癌脑膜转移患者30 例设为病例组, 其中男14 例, 女16 例；年龄35～84 岁, 平均年龄(56.17±13.62)岁。纳入标准：①颅脑MRI 扫描显示转移癌灶；②近6 个月内无颅脑损伤病史或脑炎病史, 且无颅脑手术史；③经脱水等治疗后颅内高压症状改善, 但改善不明显；④无脑脊髓膜疾病。确诊方法：11 例经肺癌根治术后病理组织检查确诊, 19 例经微创穿刺活检病理检查确诊；基因检测：除3 例未检出基因突变点, 其余27 例均发现基因突变点, 突变点多为表皮生长因子受体(EGFR)21 外显子L858R 突变, 其中3 例在EGFR 19 突变, 2 例P53 突变；从原发肿瘤发现到脑膜转移时间2 个月～5 年, 平均时间(11.02±2.33)个月。另选取同期30 例脑部非肿瘤性疾病患者设为对照组, 其中男15 例, 女15 例；年龄30～80 岁, 平均年龄(55.36±13.10)岁。纳入标准：①均为交通性脑积水；②住院治疗期间需要经腰椎穿刺、脑室外引流、腰大池引流等收集脑脊液样本行脑脊液检查。两组性别、年龄等一般资料对比差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法 肿瘤细胞整合素β1免疫组化染色 ：采用细胞玻片离心法收集两组患者的脑脊液肿瘤细胞, 加脑脊液量2.5 ml, 若为脑室引流液量较多时, 先用物理方法浓缩10 倍, 再进行细胞收集, 标本应为当天的引流液。细胞收集后玻片置37℃温箱60 min, 并采用免疫组化PV 系列二步法, DAB 显色。试剂：①整合素β1抗体(Anti-Integrin beta 1 抗体)由英国ABCAM 公司提供；②DAB 显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司；③通用型二步法试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司分公司。

1.3 观察指标及判定标准 ①分析病例组脑脊液肿瘤细胞整合素β1表达情况。②比较两组脑脊液的肿瘤细胞整合素β1阳性表达情况, 肿瘤细胞整合素β1阳性判定：整合素β1免疫组化染色DAB 显色后为棕黄色带或棕黄色颗粒, 分布于肿瘤细胞膜及细胞浆。随机计数100 个肿瘤细胞, 根据着色度和数量判断阳性细胞所占百分比。阳性程度分级：阴性(-)：阳性细胞≤4%；阳性(+)：阳性细胞5%～10%；阳性(++)：阳性细胞11%～50%；阳性(+++)：阳性细胞≥50%。阳性细胞所占比例≤10%为活性低表达, 阳性细胞≥11%为活性高表达［9,10］。③分析脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性高表达对肺癌脑膜转移的诊断效能, 包括灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

1.4 统计学方法 应用SPSS26.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组脑脊液肿瘤细胞整合素β1表达情况分析肺癌脑膜转移脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性主要呈高表达, 在胞膜及胞浆呈现明显的棕黄色带或棕黄色颗粒。见图1, 图2。其他细胞如激活型单核细胞、淋巴细胞等则不显色或颜色很淡。见图3, 图4。

图1 肿瘤细胞膜整合素β1 表达阳性(免疫组化染色×1000)

图2 肿瘤细胞浆整合素β1 表达阳性(免疫组化染色×1000)

图3 激活型单核细胞整合素β1 表达阳性(免疫组化染色×1000)

图4 淋巴细胞整合素β1 表达阳性(免疫组化染色×1000)

2.2 两组脑脊液肿瘤细胞整合素β1表达情况比较病例组整合素β1活性高表达率为80.00%, 显著高于对照组的3.33%, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组脑脊液肿瘤细胞整合素β1 表达情况比较［n(%)］

2.3 脑脊液肿瘤细胞整合素β1高表达对肺癌脑膜转移的诊断效能分析 脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性高表达诊断肺癌脑膜转移的灵敏度为80.00%(24/30),特异度为96.67%(29/30), 准确率为88.33%(53/60), 阳性预测值为96.00%(24/25), 阴性预测值为82.86%(29/35)。

3 讨论

肺癌脑膜转移病情进展较迅速, 患者预后极差,早期诊疗能够延缓病情进展, 在一定程度上延长患者的生存期。当前临床诊断肺癌脑膜转移标准［11］：①有肺癌病史；②新出现神经系统相关症状体征；③颅脑MRI 显示颅脑内癌灶征象；④脑脊液细胞学检测显示存在循环肺癌恶性肿瘤细胞。在符合①、②的基础上具有③和④中任一项即确诊。但在临床实际中90%以上脑膜转移患者的神经症状体征不明显, 颅脑MRI 诊断特异度虽可达到100%, 但其假阴性率较高,可达到65%［12］。据文献报道［13］脑脊液循环肿瘤细胞首次检测阳性率只有55%, 二次检测阳性率可升高至80%, ≥3 次检测并不会增加阳性率, 可见上述目前各种检测手段均存有优缺点, 仍需探索灵敏度、特异度更为良好的肺癌脑膜转移诊断方法。癌症最基本、最重要的病理特点是癌细胞侵袭、转移［14］。在临床上,肿瘤复发或癌灶转移是肺癌患者死亡的主要原因。国内外研究表明［15,16］, 肿瘤侵袭及其远处脏器转移是多因素共同参与的过程, 其中细胞粘附是肿瘤转移的关键环节, 而细胞外基质、细胞粘附因子在其中起着重要的作用。整合素家族、钙粘素家族、免疫球蛋白家族、选择素家族等均是目前最常见的可参与细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间粘附效应的细胞表面粘附分子, 其中整合素在肿瘤侵袭、转移过程中的作用备受关注。

3.1 整合素活性程度升高参与肿瘤侵袭、转移过程整合素作为细胞表面粘附分子家族中的重要一员, 属于跨膜受体蛋白的一种, 其广泛存在于细胞表面, 通常由一个α 键和β 键非共价联接形成跨膜异二聚体糖蛋白, 配体多是多种细胞外基质成分。整合素的生理功能主要通过与配体细胞外基质相结合, 介导细胞与细胞外基质粘附, 促使肿瘤细胞与细胞外基质的细胞内外双向信号传导, 诱发癌细胞增殖分化、迁移侵袭等病理活动［17］。据临床研究表明［18,19］, 当肿瘤细胞进入血液循环, 整合素活性度明显增高, 这有利于瘤细胞粘附于血管内皮, 使癌细胞随血流转移。

截至当前, 学者在哺乳动物体内发现了18 种α亚型和8 种β 亚型整合素［20］, 大量研究发现, 整合素β1在多种癌症转移中发挥着作用, 如肺癌［21］、乳腺癌［22］、胃癌［23］等。魏哲威等［24］研究显示, 胃癌细胞中整合素β1呈高表达, 并参与胃癌细胞迁移。整合素β1与其相应配体结合后可促使粘着斑激酶激活,形成粘着斑, 并可促使肿瘤新生血管形成, 促使癌细胞向周围正常组织侵袭, 进而参与肿瘤迁移、远处脏器转移瘤形成。本研究证实, 肺癌脑膜转移患者整合素β1活性度较脑部非肿瘤患者明显增高, 且肺癌脑膜转移患者脑脊液中80%癌细胞整合素β1活性度为(++)与(+++), 提示肺癌细胞从原发癌灶中脱落粘附于邻近组织脏器, 进而对远处脏器转移有促进作用。临床上肺癌一旦出现脑膜转移, 在中枢神经系统会出现明显的阳性体征, 如头痛、恶心、呕吐或认知功能障碍等。脑脊液检查也会出现明显异常, 如葡萄糖降低、总蛋白质增高、肿瘤细胞明显增多等。细胞学分析瘤细胞胞体巨大, 是小淋巴细胞5～10 倍以上, 核分裂相增多、核染色质粗、核内有明显的核仁、胞浆嗜碱性, 并含有空泡［25］, 这些都与癌细胞整合素活性程度高有明显相关性。

3.2 脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性检测诊断肺癌脑膜转移临床效能较高 本研究采用细胞玻片离心法收集腰穿脑脊液中的肿瘤细胞, 由于第二代细胞玻片离心仪［26］收集管容量大且密封性能好, 离心后细胞流失极少, 极大提高脑脊液中肿瘤细胞收集效果。经免疫组化染色后, 根据阳性分级程度［27,28］, 本组阳性细胞平均为43.2%, 最高为84%, 且本研究还发现脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性高表达诊断肺癌脑膜转移的灵敏度为80.00%, 特异度为96.67%, 准确率为88.33%, 阳性预测值为96.00%, 阴性预测值为82.86%, 提示脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性检测诊断特异度高, 这可能是脑脊液中癌细胞数量多, 也明显提高肿瘤细胞收集与组化染色效果, 但其灵敏度相对稍低, 30 例患者中仍有3 例脑脊液肿瘤细胞整合素β1表达为阴性, 这可能是由于脑膜转移处于发展初期, 癌细胞数量较少, 故其阳性细胞低于4%, 整合素呈低活性度。

癌性脑膜炎癌细胞整合素β1活性度增高, 有利于癌细胞的侵袭、生长, 同时也加剧病情的恶化, 特别在病情进展时, 化疗、靶药仍无法控制癌细胞扩散情况下, 通过应用整合素靶向药物调控整合素的活性程度将有效控制病情发展［26-29］。时刻监测脑脊液肿瘤细胞整合素β1活性对肺癌脑膜转移病情的发展或复发起重要作用。

综上所述, 肺癌脑膜转移患者脑脊液中肿瘤细胞整合素β1活性度明显增高, 故检测脑脊液中肿瘤细胞整合素β1活性度有助于提高本病鉴别诊断能力。