卢彦春，张 蕾，穆长征，李伟伟，金 辉

(1辽宁医学院生物化学教研室，辽宁锦州 121000;2辽宁医学院附属第三医院)

研究表明，多种细胞因子及信号通路共同参与神经分化的调控机制，其中卵泡抑素(FS)能够诱导神经分化，并拮抗激活素(Activin)的生物活性进一步抑制胞内的Smad3的信号激活［1］。有学者认为，FS作为Activin特异结合蛋白，还可与TGF-β家族的其他成员结合，如骨形态发生蛋白(BMPs)、myostatin等，并抑制BMP信号而达到神经诱导作用的。而最新研究表明，FS没有阻止BMP信号，其功能主要是作为 Activin抑制剂，而不是 BMP配体［2］。2010年4月～2012年3月，我们通过观察鼠神经发育不同阶段和部位FS、Activin A与BMP-4基因的表达变化及定位情况，以探讨神经细胞诱导和分化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 取同期受孕SD大鼠30只，由辽宁医学院科学实验动物中心提供。将30只大鼠按照胎鼠发育时间分为胚胎8.5 d(E8.5组)、13 d(E13组)、18 d(E18组)及出生后3 d(P3组)、7 d(P7组)、30 d(P30组)各5只。

1.2 FS、Activin A、BMP-4 表达检测 E8.5 组、E13组、E18组中每只孕鼠取5只胎鼠，断头取脑，经40 g/L(4%)多聚甲醛固定;P3组、P7组、P30组各取5只幼鼠经腹腔麻醉，打开胸腔，用300 mL(0.1 mol/L)PBS(pH7.4)经左心室灌注冲洗，再用40 g/L(4%)多聚甲醛磷酸盐缓冲液300 mL缓慢灌注固定。应用脑立体定位仪分别切取包含皮质、纹状体、海马、嗅球组织的脑片，石蜡包埋，连续进行冠状切片(厚度为5 μm)，每4张取1张，行免疫组化染色。观察 FS、Activin A、BMP-4 在皮质、纹状体、海马、嗅球处表达。免疫组化染色操作步骤按SABC免疫组化染色试剂盒操作说明进行。

1.3 统计学方法 所得数据输入计算机，用SPSS for Windows 10.0版本软件进行t检验和方差分析，结果以±s表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 皮质 各组皮质阳性细胞分布均匀，FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，在E13组皮质的锥体细胞层，细胞着色较深，提示此层细胞FS(图1)与Activin A(图2)含量较多，P7组与P30组阳性细胞较少且着色最弱。BMP-4在E8.5～P7组阳性细胞较少，在P30组阳性细胞显著增多，可见胞质染色较强的细胞，主要分布于颗粒层和锥体细胞层(图3)。

2.2 纹状体 FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，E13组与E18组阳性细胞数减少且着色较强，可见胞质染色较强的细胞，主要分布于颗粒层(FS见图4、Activin A见图5)，P3组阳性细胞数低于E18组，P7组和P30组阳性细胞较少且着色最弱。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞较少，着色相对较弱，在P30组阳性细胞显著增高，细胞着色深，主要分布于颗粒层(图6)。

2.3 海马 FS与Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，E13组明显少于E18组，齿状回阳性细胞体积较小，数目较多，E8.5组到P7组各亚区阳性细胞数都较多，细胞着色深，主要分布在锥体细胞层、颗粒层(FS见图7、Activin A见图8)，P30组阳性细胞数进一步减少。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞数极少且着色极弱，P30组阳性细胞着色较强，细胞着色深，集中在锥体细胞层、颗粒层(图9)。

2.4 嗅球 FS和Activin A在E8.5组阳性细胞最多。E13组阳性细胞数略减少，E18组与P3组阳性细胞数略少于E13组，分布于各层，胞质呈深棕黄色，核空泡状，僧帽细胞可见阳性突起(FS见图10、Activin A见图11)，P7组到 P30组进一步减少。BMP-4在E8.5组到P7组阳性细胞数较少，P30组阳性细胞增多，呈高表达，阳性细胞均在纤维层、僧帽细胞层、颗粒细胞层、髓层较多(图12)。

图1 ～12 大鼠大脑皮质、纹状体、海马、嗅球内FS、Activin A与BMP-4免疫组化染色(×400)

3 讨论

研究表明，多种细胞因子及信号通路共同参与神经分化的调控机制，成体神经发生亦受缺血、运动等众多因素的影响［3，4］。其中，Fs能够诱导神经分化，并拮抗Activin的生物活性进一步抑制胞内的Smad3 的信号激活［1］。Shoji-Kasai等［5］发现，体外培养的海马神经元突触数量和树突长度的增加有赖于Activin A。新近的实验表明，Activin A具有促进原代培养背根神经节神经元神经突起生长、抑制神经损伤分子NO释放作用，与神经生长因子具有协同效应［6，7］。根据配体中的半胱氨酸残基的分布将TGF-β家族成员区别为三个亚群，即标准TGF-βs家族、activin/inhibins家族、BMPs家族。Fs与 Activin和Myostatin以高亲和力结合形成基本不可逆的复合物，阻止了受体配体的相互作用，在脊椎动物中几个作为TGF-β配体亚家族的拮抗剂均与Fs有关。

Bickel等发现，BMP和Activin配体均为FS作用的靶点。而最新研究表明，FS没有阻止BMP信号，其功能主要是作为Activin抑制剂，而不是BMP配体，这与Bickel的研究不同。本实验发现大鼠大脑皮质和纹状体内FS、Activin A在E8.5组阳性细胞数最多，在E13组与E18组阳性细胞数减少，P3组阳性细胞数低于E18组，P7组及P30组细胞着色最弱，而BMP-4基因呈现相反的表达，在E8.5组至P3组着色相对较弱，在P7组开始增强，在P30组阳性细胞显著增高，提示Fs对 ACT的拮抗特点与Bickel研究结果相吻合，而Fs与BMP-4的表达呈相反波动趋势。

众所周知，神经板是最早出现的神经系统发育的结构。参与神经板发生的主要有BMP、Fs、Chorclin和Noggin。Fs是一类分泌性因子，表达于原肠胚期的组织原区及动物极性外植体中。新近研究发现，皮层、纹状体、黑质、杏仁核、海马CAI区、脑干背侧迷走神经复合体、室旁核都有神经发生［8］。本文结果表明，FS、Activin A在大鼠海马E8.5组阳性细胞数最多，E13组明显低于E8.5组，而BMP-4在此时的着色极弱，提示FS与Activin A蛋白能够抑制BMP-4的作用，可能对胚胎期和成年期海马的神经发生调控起重要作用。近来研究也表明，在出生后20 d至成年阶段齿回能产生颗粒细胞，然而和胚胎期及新生期相比，数量明显减少［8］。成年大鼠神经元前体细胞的迁移流主要有两条路径:一条是从SVZ到嗅球的RMS;另一条是位于皮层和胼胝体周围迁移流［3］。研究发现，大鼠嗅球存在两次嗅感觉神经细胞凋亡高峰，分别在胚胎13 d和出生后第5天，随着嗅球的神经发生，嗅感觉神经细胞发育成熟［9，10］。本研究发现，FS 和 Activin A 在 E8.5 组嗅球阳性细胞分布于各层，着色最强。E13组阳性细胞数略减少，而BMP-4在此时阳性细胞数较少。FS和ACT在E18组至生后P3组呈中等强度表达，阳性细胞数略少于E13组，二者在P7组进一步减少，P30组降至最低。而BMP-4在P7组阳性细胞数较少，P30组阳性细胞增多，呈高表达，由此推测FS和Activin A蛋白能够抑制BMP-4的作用从而阻止嗅上皮的嗅感觉神经细胞凋亡的发生。

总之，FS在神经诱导的调控机制的过程中与Activin A和BMP-4密切相关，作为外胚层的内部因素在正常发育中有重要意义。但神经发育调控机制复杂，尚需进一步的探索研究。

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