梁正，聂署萍

中山大学附属第八医院检验科，广东深圳518033

B族链球菌（GBS）是一种条件致病菌，常定植于人体下消化道或泌尿生殖道，孕妇GBS定植率为10%～30%［1］。母体泌尿生殖道和胃肠道GBS定植是新生儿早发型GBS感染的主要危险因素，大约50%的GBS定植孕妇会在分娩期间将细菌垂直传播给新生儿。新生儿早发型GBS感染可引起脓毒血症、脑膜炎等严重疾病［2-3］。对妊娠35～37周孕妇进行GBS筛查并对GBS阳性孕妇分娩前给予抗生素治疗是目前新生儿早发型GBS感染的重要预防策略［4-5］。此外，由于母体IgG抗体能够透过胎盘给胎儿提供免疫保护，因此孕妇接种GBS疫苗也是预防新生儿GBS感染的重要措施，GBS表面的荚膜多糖抗原是目前疫苗研发的主要靶点之一［6］。根据荚膜多糖抗原成分将GBS分为10种血清型（Ⅰa、Ⅰb及Ⅱ～Ⅸ型），不同国家和地区间GBS血清型分布有明显差异。了解本地区围生期孕妇GBS定植率和血清型分布，有利于制定合理有效的预防措施。生物膜是细菌为了适应生存环境而形成的一种存在形式，生物膜状态下的细菌对抗菌药物的抗性和对宿主免疫系统的逃避能力显著增强，有利于细菌在宿主体内持续定植和扩散。GBS具有形成生物膜的能力［7］，了解孕妇阴道和直肠定植GBS菌株的生物膜形成情况，可为预防及治疗GBS感染提供新方向。本研究通过采集行GBS产前筛查孕妇的阴道和直肠拭子检查，分析GBS定植率、血清型及生物膜形成能力，旨在为临床GBS感染性疾病的预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经医院伦理委员会批准（批号：2022-063-01），通过实验室信息系统查询2021年8月—2022年7月在中山大学附属第八医院产科门诊行GBS产前筛查的2 141例妊娠35～57周孕妇电子病例，获取相关临床资料及标本资料。

1.2 GBS培养与鉴定 采集阴道下段1/3处及肛门直肠处拭子标本送检。将采集的直肠及阴道拭子接种于显色培养基，置于5% CO2培养箱中，35 ℃孵育24 h。挑取显色培养基上的紫红色菌落，用全自动微生物鉴定药敏分析系统VITEK 2-Compact（法国Biomerieux）进行菌种鉴定。

1.3 GBS血清分型检测 随机选取分离的67株GBS，使用细菌基因组抽提试剂盒抽提菌株DNA，采用多重PCR方法检测其荚膜血清型。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶120 V电泳120 min，使用凝胶成像系统观察结果。

1.4 GBS生物膜形成能力观察 取上述已进行血清分型的67株GBS，采用流加培养模式进行生物膜形成试验。挑取单个菌落，用THB培养基（pH=7.8）+1%葡萄糖培养基配制成终浓度为1.5×107CFU/mL的菌悬液。将配好的菌悬液以200 μL/孔加入无菌96孔聚苯乙烯板中，密封后置于37 ℃摇床中孵育8 h。用PBS洗去浮游的细菌，加入200 μL新鲜培养基，重新密封后，置摇床中继续孵育5 h。弃去上清，用PBS洗3次，室温干燥30 min。采用结晶紫染色法评估生物膜形成的量。以阴性孔的平均OD值0.16为截断值，将GBS菌株分为强生物膜（OD595＞0.84）、中度生物膜（0.32＜OD595≤0.84）、弱生物膜（0.16＜OD595≤0.32）、非生物膜（OD595≤0.16）。每块96孔板分别设3个空白对照孔（未加培养基及细菌）和3个阴性对照孔（只加培养基），每株细菌设3个复孔，试验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验及Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直肠和阴道GBS定植率比较 2 141例围生期孕妇中，阴道拭子检出GBS 232株，定植率为10.84%。直肠拭子检出301株，定植率为14.06%；阴道、直肠拭子联合共检出GBS 349株，总定植率为16.30%。直肠GBS定植率高于阴道（P＜0.01）。

2.2 GBS血清学分型结果 67株GBS共检出5种血清型，其中Ⅰa型9株（来源于直肠5株、阴道4株），Ⅰb型9株（来源于直肠4株、阴道5株），Ⅱ型1株（来源于直肠），Ⅲ型22株（来源于直肠15株、阴道7株），Ⅴ型26株（来源于直肠14株、阴道12株）。直肠和阴道定植的GBS血清型分布差异无统计学意义（P均＞0.05）。部分菌株荚膜血清型多重PCR结果见图1。

图1 部分菌株荚膜血清分型电泳图

2.3 GBS生物膜形成能力检测结果 67株GBS中，形成强生物膜11株，中等强度生物膜26株，弱生物膜30株。

2.4 不同血清型和部位来源GBS生物膜形成能力比较 5种血清型GBS生物膜形成能力比较，差异无统计学意义（P均＞0.05），见表1。直肠GBS生物膜形成能力较阴道GBS增强（P＜0.01），见表2。

表1 不同血清型GBS生物膜形成能力比较（株）

表2 不同部位来源GBS生物膜形成能力比较（株）

3 讨论

围生期孕妇GBS定植率、血清型分布与种族、地域以及社会经济状况相关，了解本地区的定植率和血清型分布情况对合理制定GBS感染的预防措施有重要意义。据报道，全球孕妇GBS定植率约15%，以加勒比海地区最高为34%，最低的为美拉尼西亚地区，仅2%；欧洲、北美洲以及澳大利亚等地区定植率相似，为18%，南非地区的定植率为25%，西非地区为14%，南亚及东南亚地区为10%［1］。我国不同地区围生期孕妇GBS定植率也存在明显差异，江苏地区为8.7%，北京地区为7.1%，青岛地区为10.6%［8-10］。本研究中2 141例围生期孕妇GBS定植率为16.3%，明显高于文献报道。这种差异可能与研究时间、采样部位、采样方法的不同有关，因此需要进行连续监测。

既往研究显示，全球孕妇直肠、阴道定植的GBS血清型均以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型为主，占总体血清型的98%；但是不同地区主要流行的GBS血清型存在差异，如Ⅲ型占全球总体流行血清型的25%，但在中美洲、东南亚等地区仅占11%［1］。本研究在围生期孕妇中共检出Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型5种血清型，直肠和阴道定植的GBS在血清型分布上无统计学差异，总体以Ⅲ型和Ⅴ型为主，分别占32.8%、38.9%。该结果与本地区2018年报道的Ⅲ型占60.7%［11］略有不同，提示GBS流行血清型可随时间迁移而变化，因此需进行定期监测。此外，本地区的研究结果与我国其他地区也有差异，如厦门地区孕妇定植GBS血清型以Ⅲ型（54.2%）和Ⅰb型（17.7%）为主［12］，青岛地区以Ⅲ型（44.4%）和Ⅰb型（31.5%）为主［10］。了解本地区流行的流行情况，有助于更好地、有针对性地预防母婴GBS感染。

生物膜能够帮助细菌抵御外环境的变化，抵抗抗生素的杀伤及逃避宿主免疫，维持细菌在宿主体内的持续定植［13-14］。本研究结果显示，不同GBS菌株的生物膜形成能力存在明显差异，可能是造成GBS在宿主体内呈现间歇性、暂时性或持续性等不同定植状态的原因［15］。本研究中孕妇直肠和阴道定植的GBS以中、弱生物膜形成株为主，不同血清型GBS生物膜形成情况比较差异无统计学意义；而不同部位来源GBS生物膜形成能力存在差异，直肠定植的GBS生物膜形成能力比阴道定植的菌株强，可能是造成GBS在直肠定植率高于阴道的原因。目前国内外关于GBS定植机制的研究少见，下一步我们将重点研究生物膜在宿主GBS定植中的作用。

综上所述，围生期孕妇GBS定植率较高，血清型以Ⅲ型和V型为主。定植菌株整体生物膜形成能力较弱，直肠定植的菌株生物膜形成能力强于阴道定植株，可能与直肠定植率高有关，其具体机制仍有待进一步研究。