孟元元，刘艳，张华强，周民，姚玲玲

1 武汉科技大学附属普仁医院麻醉科，武汉430000；2 湖北文理学院附属医院 襄阳市中心医院疼痛科

研究表明，蛛网膜下腔出血（SAH）发病后72 h内发生的早期脑损伤是导致患者高病死率和高致残率的主要原因，其发生与多种病理机制相关，而神经炎症被认为在SAH后早期脑损伤中发挥重要作用［1-2］。环腺苷酸（cAMP）作为重要的第二信使，介导许多细胞内信号级联反应，包括蛋白激酶A（PKA）/环腺苷酸应答元件结合蛋白（CREB）信号通路。动物实验表明，cAMP/PKA/CREB信号通路与抑郁症及认知功能障碍的发病机制密切相关［3］。已有研究发现，TGR5激动剂INT-777通过激活cAMP/PKA信号通路减弱SAH发病后脑损伤中神经炎症，改善SAH后的短期神经行为功能［4］。咪达唑仑（MDZ）作为一种常用的麻醉剂，具有水溶性、起效快、作用时间短等特点，并对人脑的神经基础产生药理学作用［5］，但目前尚无研究报道MDZ对SAH发病后的神经保护作用。2022年3月—12月，我们对SAH大鼠给予MDZ进行干预，观察其对神经炎症的影响，探讨其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8周龄健康雄性Wistar大鼠65只，体质量280～320 g，购自广州检验检测认证集团有限公司，许可证号：SYXK（粤）2022-0299。饲养条件：室温（22 ± 1）℃，湿度60% ± 5%，12 h昼夜循环。自由饮食饮水。本研究经动物护理和使用委员会批准，并按照《实验动物护理和使用指南》进行。

1.1.2 主要试剂与仪器 MDZ购自浙江恩华药业股份有限公司；PKA抑制剂H-89购自美国MedChemexpress公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6蛋白质提取试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；ECL试剂购自美国Amersham Biosciences公司；cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗购自英国Abcam公司。Synergy LX多功能酶标仪购自美国BioTek公司；BX61光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 动物分组与SAH模型制备 将大鼠随机分为假手术组10只和造模组55只，参照文献［6］方法制备SAH模型。腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉大鼠，俯卧位固定。在枕外隆凸附近切开，剪开浅层肌肉，显露颈夹肌间隙，对环枕膜、枕骨进行初步定位。抽取股动脉血3.5 mL，在2 min内注入枕大池，注入后保持30°低头30 min，使血液沉积在脑底血管。间隔48 h后，同样方法抽取另一侧股动脉血注入枕大池。当观察到大鼠脑底基底池部位有明显的血液存在，并有脑脊液漏出，表明SAH造模成功。假手术组进行上述同样操作，向枕大池注入等体积生理盐水。

1.3 药物干预方法 取SAH造模成功的50只大鼠，随机分为SAH组、MDZ低剂量组、MDZ中剂量组、MDZ高剂量组、MDZ高剂量+H-89组，每组各10只。MDZ高、中、低剂量组分别经颈静脉注射0.30、0.15、0.05 mg/kg MDZ，同时腹腔注射等体积生理盐水；MDZ高剂量+H-89组经颈静脉注射0.3 mg/kg MDZ，同时腹腔注射5 mg/kg H-89；SAH组、假手术组颈静脉及腹腔注射等体积生理盐水。每天1次，连续3 d。

1.4 神经功能评估 末次给药2 h后，参照改良的Garcia神经功能评分系统［7］，从自主活动、四肢运动对称性、前肢伸展、攀爬抓握、双侧躯干触觉反应、触角反应6个方面评估各组大鼠的神经功能，最低3分，最高18分，评分越低表示神经功能损伤越严重。

1.5 血清炎症因子检测 采用ELISA法。采集大鼠静脉血，使用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α、IL-6含量，具体步骤按照试剂盒说明。

1.6 脑含水量检测 采用干/湿法。各组随机取3只大鼠，在深度麻醉下将大鼠斩首，摘除大脑，取出同侧脑组织，立即使用电子天平称取湿重。将脑组织置于100 ℃恒温烘箱中48 h至恒重，使用电子天平称取干重。以（湿重－干重）/湿重×100%计算脑含水量。

1.7 SAH等级评分 取各组剩余的7只大鼠，对大脑基底表面的6个区域进行SAH等级评估。0级：无蛛网膜下腔血液；1级：少量蛛网膜下腔血液；2级：具有肉眼可见的中度血块；3级：血块阻塞了所有动脉。

1.8 脑组织形态学观察 采用HE染色。SAH等级评分结束后，取部分海马区脑组织，加入4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切成4 μm厚的切片。石蜡切片脱蜡、复水、苏木精染色60 s，1%盐酸乙醇染色3 s，最后伊红染色1 min。使用中性树胶将切片密封到载玻片上，光学显微镜400倍视野下观察组织形态学损伤情况。

1.9 脑组织cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白检测 采用Western blotting法。取剩余部分脑组织，使用蛋白质提取试剂盒提取蛋白质。通过SDSPAGE分离样品中的蛋白质，湿转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，4 ℃下与cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗（稀释浓度均为1∶1 000）孵育24 h。用Tris缓冲盐水洗涤后，加入二抗，室温孵育1 h。加入ECL试剂使印迹条带可视化，用Image J软件进行定量分析。

1.10 统计学方法 采用SPSS27.0统计软件。数据分布的正态性通过Kolmogorov-Smirnov检验进行分析，呈正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 假手术组、SAH组、MDZ低剂量组、MDZ中剂量组、MDZ高剂量组、MDZ高剂量+H-89组神经功能评分分别为（21.23 ±2.14）、（5.55 ± 0.56）、（8.92 ± 0.90）、（14.24 ±1.44）、（18.42 ± 1.85）、（9.25 ± 0.93）分。与假手术组比较，SAH组神经功能评分降低（P＜0.05）；与SAH组比较，MDZ低、中、高剂量组评分均升高，其中高剂量组高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组（P均＜0.05）；MDZ高剂量+H-89组评分较MDZ高剂量组降低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比较与假手术组比较，SAH组血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P均＜0.05）；与SAH组比较，MDZ低、中、高剂量组IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，且高剂量组低于中、低剂量组，中剂量组低于低剂量组（P均＜0.05）；MDZ高剂量+H-89组血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平较MDZ高剂量组升高（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清炎症因子水平比较（ng/mL，）

表1 各组大鼠血清炎症因子水平比较（ng/mL，）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与SAH组比较，bP＜0.05；与MDZ低剂量组比较，cP＜0.05；与MDZ中剂量组比较，dP＜0.05；与MDZ高剂量组比较，eP＜0.05。

TNF-α 0.72 ± 0.08 6.72 ± 0.68a 4.21 ± 0.43b 2.16 ± 0.23bc 1.15 ± 0.12bcd 4.33 ± 0.45e组别假手术组SAH组MDZ低剂量组MDZ中剂量组MDZ高剂量组MDZ高剂量+H-89组n 10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.88 ± 0.09 6.82 ± 0.69a 4.62 ± 0.47b 2.55 ± 0.26bc 1.04 ± 0.11bcd 4.72 ± 0.48e IL-6 0.38 ± 0.04 42.15 ± 4.23a 27.82 ± 2.79b 12.35 ± 1.24bc 4.62 ± 0.48bcd 25.46 ± 2.55e

2.3 各组大鼠脑含水量比较 假手术组、SAH组、MDZ低剂量组、MDZ中剂量组、MDZ高剂量组、MDZ高剂量+H-89组脑含水量分别为58.15% ± 2.06%、82.77% ± 3.11%、72.88% ± 2.61%、67.88% ±2.39%、60.21% ± 2.09%、76.08% ± 2.47%。与假手术组比较，SAH组脑含水量升高（P＜0.05）；与SAH组比较，MDZ低、中、高剂量组脑含水量降低，且高剂量组低于中、低剂量组，中剂量组低于低剂量组（P均＜0.05）；MDZ高剂量+H-89组脑含水量较MDZ高剂量组增加（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠SAH等级评分比较 假手术组、SAH组、MDZ低剂量组、MDZ中剂量组、MDZ高剂量组、MDZ高剂量+H-89组大鼠SAH等级评分分别为（0.00 ± 0.00）、（17.11 ± 1.72）、（11.34 ± 1.14）、（7.24 ± 0.73）、（4.26 ± 0.43）、（11.83 ± 1.19）分。与假手术组比较，SAH组评分升高（P＜0.05）；与SAH组比较，MDZ低、中、高剂量组评分均降低，且高剂量组低于中、低剂量组，中剂量组低于低剂量组（P均＜0.05）；MDZ高剂量+H-89组评分较MDZ高剂量组增加（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠脑组织海马区形态学变化 假手术组海马组织神经细胞排列整齐，结构正常；SAH组神经元细胞核碎裂，出现细胞坏死现象，MDZ低剂量组、MDZ中剂量组、MDZ高剂量组神经元细胞损伤逐渐减轻，MDZ高剂量组趋于正常化；MDZ高剂量+H-89组较MDZ高剂量组神经元细胞损伤加重。见OSID码图1。

2.6 各组大鼠脑组织cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达水平比较 SAH组cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达水平较假手术组降低（P均＜0.05）；MDZ低、中、高剂量组较SAH组增加（P均＜0.05）；MDZ高剂量+H-89组较MDZ高剂量降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达比较（）

表2 各组大鼠脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达比较（）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与SAH组比较，bP＜0.05；与MDZ低剂量组比较，cP＜0.05；与MDZ中剂量组比较，dP＜0.05；与MDZ高剂量组比较，eP＜0.05。

p-CREB/CREB 0.94 ± 0.10 0.11 ± 0.02a 0.33 ± 0.04b 0.65 ± 0.07bc 0.89 ± 0.10bcd 0.36 ± 0.04e组别p-PKA/PKA假手术组SAH组MDZ低剂量组MDZ中剂量组MDZ高剂量组MDZ高剂量+H-89组n7 7 7 7 7 7 cAMP/β-actin 1.08 ± 0.11 0.25 ± 0.03a 0.44 ± 0.05b 0.69 ± 0.07bc 0.93 ± 0.10bcd 0.43 ± 0.05e 0.99 ± 0.10 0.18 ± 0.02a 0.39 ± 0.04b 0.62 ± 0.07bc 0.92 ± 0.10bcd 0.38 ± 0.04e

3 讨论

早期脑损伤是SAH后不良结局的主要原因，包括SAH后脑水肿、血脑屏障破坏、神经细胞的凋亡等病理变化［8］。神经炎症是SAH诱导的早期脑损伤中关键的病理过程之一［9］。研究显示，抑制神经炎症可减轻大鼠SAH后的脑水肿和神经元损伤，缓解早期脑损伤，进而改善SAH的预后［10-11］。因此，在SAH的情况下，针对神经炎症的治疗将减弱早期脑损伤并有利于改善神经系统预后。MDZ是一种苯二氮䓬类药物，主要通过苯二氮䓬受体作用于脑干和边缘系统，属于新型神经毒剂抗惊厥药。除了抗癫痫作用外，MDZ还具有抗炎作用，可以抑制神经炎症因子释放［12］。研究发现，MDZ可通过减少BV-3小胶质细胞中的NLRP3炎症小体活化和促炎细胞因子释放来发挥神经保护作用［13］。TANG等［14］报道，MDZ对缺氧/复氧引起的脑损伤具有神经保护作用。此外，临床研究显示，咪达唑仑联合芬太尼的镇静镇痛能够改善重症SAH患者的脑代谢，具有较好的治疗效果［15］。二次枕大池注血是目前构建SAH模型较为理想且最为认可的造模方式，具有操作简单、成功率高、动物病死率低等优点。脑水肿是SAH后的重要早期病理生理改变，也是导致SAH患者神经功能障碍的重要因素；神经炎症反应可导致神经元细胞功能损伤和线粒体功能异常，是SAH后脑水肿发生发展的关键机制。本研究采用二次枕大池注血法构建SAH大鼠模型，通过Garcia评分、脑含水量、SAH等级评分等评估MDZ对大鼠神经功能及早期脑损伤的影响。结果显示，SAH大鼠神经功能评分降低，脑含水量、SAH等级评分以及神经炎症因子均增加，表明SAH大鼠神经功能受损；MDZ干预能够降低SAH大鼠脑含水量、SAH等级评分以及神经炎症因子水平，减轻SAH后的神经功能损伤，改善脑水肿，表明MDZ是一种有效的抗SAH后早期脑损伤的神经保护药物。

cAMP作为重要的第二信使，参与学习记忆过程和突触长期可塑性的改变；CREB是cAMP胞核内核蛋白，海马区磷酸化的CREB是调节中枢神经系统的重要核内转录因子，具有多种生物学功能，包括参与调节学习、记忆能力、改善认知功能等，是多种信号转导通路的关键调节成分［16］。CREB主要对PKA等信号发生应答反应，cAMP激活PKA后，活化的PKA进入细胞核，可磷酸化激活CREB［17］。JIN等［18］报道，在脓毒症大鼠模型中，激活cAMP/PKA/CREB信号轴可通过减少海马体内小胶质细胞的数量、中性粒细胞浸润和炎症因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达，抑制神经炎症来预防认知障碍。XIN等［19］报道，抑制SAH后的cAMP-CREB途径可诱导少突胶质细胞分化和髓磷脂损伤。HU等［4］报道，在SAH大鼠模型中，INT-777可通过激活cAMP/PKA信号通路，抑制神经炎症，减轻脑水肿和SAH后的神经功能缺损；而PKA抑制剂H-89可逆转INT-777对SAH后神经行为结局的神经保护作用。以上研究表明cAMP/PKA/CREB通路是改善SAH后脑损伤和神经功能障碍的重要治疗靶点。本研究结果显示，SAH后大鼠脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达显著下降，说明cAMP/PKA/CREB信号通路被抑制；伴随着神经炎症因子水平IL-1β、TNF-α、IL-6和脑组织含水量的增加以及严重的神经元损伤，再次证实cAMP/PKA/CREB信号通路抑制与SAH后早期脑损伤的发生发展有关。给予不同剂量MDZ干预后，大鼠海马组织中cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达上调，神经炎症因子水平降低，神经元损伤得到缓解，推测MDZ可以通过激活cAMP/PKA/CREB通路抑制炎症反应，改善SAH大鼠神经元损伤。为验证该实验推测，本研究在MDZ干预的基础上应用PKA抑制剂H-89进行实验，结果发现H-89明显减弱了MDZ对SAH大鼠的神经保护作用，提示MDZ抑制神经炎症、缓解早期脑损伤的作用可能是通过激活cAMP/PKA/CREB通路实现的。

综上所述，MDZ能够抑制神经炎症，减轻SAH大鼠早期脑损伤，改善其神经功能，其机制可能与激活cAMP/PKA/CREB通路有关。本研究仅从动物水平进行了初步探究，后续可考虑从体外细胞水平进行深入研究。此外，SAH的发病机制复杂，MDZ能否通过其他信号通路对SAH发挥神经保护作用仍需进一步探讨。