徐婋，卢涛，李珂，徐佳宁，刘小愉，杜鹏云，张成岗

北京中医药大学生命科学学院，北京102488

食盐和糖在提供能量、维持生命基本活动和健康维护中起重要作用。WHO推荐，成年人每天摄入食盐不超过5 g、糖不超过25 g。调查显示，中国北方地区居民平均每日食盐摄入量为11.2 g，南方地区居民为10.2 g［1］；我国9省（广西壮族自治区、贵州、湖南、湖北、江苏、河南、山东、辽宁和黑龙江）平均每日糖摄入量为31.3 g［2］，明显超过WHO推荐量。糖摄入过量会引发胰岛素抵抗、慢性血管病、肾功能损害以及心血管疾病［3-4］；食盐摄入过量则是高血压、心脏病等心血管疾病、脂肪肝、痴呆、慢性肾脏病和中风的危险因素［5-6］。长期高盐高糖饮食与肥胖的发生密切相关，在摄入糖和盐的过程中，大脑分泌大量阿片类物质以及多巴胺，阿片类物质与成瘾性有关，多巴胺使人产生愉悦感；并且糖和盐会降低乙酰胆碱的释放，从而降低饱腹感，容易诱发暴食。肥胖对人体的呼吸系统、心血管系统、内分泌系统以及免疫系统都会产生不良影响，从而缩短人的寿命；对儿童及青少年来说，肥胖还会影响生长发育和心理状态。因此，减少人们对盐和糖的摄取从而控制肥胖的发生率势在必行。黄连素又称小檗碱，是我国传统中药黄连的主要有效成分，是一种天然的季铵类异喹啉生物碱，目前在临床上已被广泛用于与盐、糖代谢相关疾病的治疗中，在应用磺脲类及二甲双胍等治疗2型糖尿病药物时添加黄连素可进一步提高治疗效果［7-8］。线虫daf-2基因是人胰岛素受体蛋白相关基因的同源基因，daf-16基因为其下游基因。2022年8月—2023年4月，我们以秀丽线虫建立高盐高糖饮食模型，探讨黄连素对高盐高糖诱导的秀丽线虫形态及寿命改变的干预作用，检测其对线虫daf-2、daf-16基因表达的影响，旨在为临床使用黄连素缓解和纠正人体因高盐高糖饮食导致的肥胖和寿命缩短提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 野生型N2秀丽隐杆线虫、大肠杆菌OP50由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所提供。黄连素为麦克林公司产品。琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司），蛋白胨（美国赛默飞公司），氯化钠（天津市大茂化学试剂厂），葡萄糖—水合物（天津市光复科技发展有限公司），氢氧化钠溶液（国家化学试剂质检中心），M9盐溶液（10×，pH7.4），恒温生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），体视显微镜（广州市明美光电技术有限公司）。

1.2 线虫的基本培养 将线虫放置于涂布有大肠杆菌OP50的培养基上，置于20 ℃恒温生化培养箱培养。每3～4 d切胶转板1次，以保证线虫有足够的食物和生活空间，同时注意保持培养基洁净。实验开始前将线虫进行同步化处理，培养至L1期（相当于人类3岁）用于后续实验。

1.3 高盐和高糖培养基的配制 高盐培养基：正常线虫NGM培养基中氯化钠浓度为0.3%，根据我国居民食盐摄入超标倍数，设置氯化钠浓度为0.7%。向50 mL线虫NGM培养基中添入0.35 g氯化钠，配制成氯化钠浓度为0.7%的培养基。高糖培养基：向50 mL线虫NGM培养基中加入0.5 g葡萄糖水合物，配制成葡萄糖浓度为1%的培养基［9］。高盐高糖培养基：向50 mL线虫NGM培养基中添加0.5 g葡萄糖水合物和0.35 g氯化钠，配制成葡萄糖含量为1%、氯化钠含量为0.7%的培养基。

1.4 实验组黄连素干预浓度的确定 以M9盐溶液为溶剂配制0、1、10、20、50 mg/L黄连素溶液。每个浓度设置3个60 mm直径线虫NGM培养皿，加入0.2 mL对应浓度的黄连素溶液，培养10 d，计算总存活率。结果显示，与0 mg/L黄连素比较，1、10、20 mg/L黄连素干预下的线虫总存活率无统计学差异，50 mg/L黄连素干预下的线虫总存活率降低，故后续实验选择黄连素浓度10 mg/L和20 mg/L。

1.5 线虫分组与干预方法 将线虫分为正常对照组、高盐组、高糖组、高盐高糖组。正常对照组加入线虫NGM培养基；高盐组、高糖组、高盐高糖组下设模型对照组、10 mg/L黄连素干预组、20 mg/L黄连素干预组，先分别加入高盐培养基、高糖培养基、高盐高糖培养基，然后向黄连素干预组中加入相应浓度的黄连素溶液。使用直径60 mm的培养皿，置于20 ℃恒温培养箱中培养。

1.6 线虫生长指标观察 于培养第1、3、6天，每组随机选取30条线虫，在体视显微镜下进行观察。使用MShot Image Analysis System显微测量软件截取线虫图片，使用Image J图像处理软件测定线虫体长和体宽（虫体中部最宽部分），以像素（pixels）作为单位，1 mm=（436.47 ± 0.15）pixels。

1.7 线虫寿命统计 每组随机选取30条线虫，于20 ℃恒温培养箱中培养，每2 d将线虫挑至新的培养基，直至线虫全部死亡。记录30条线虫的寿命，取平均数。

1.8 线虫daf-2、daf-16 mRNA检测 采用RT-qPCR法。培养第6天，每组随机选取30只线虫，加液氮后研磨。采用TRIzol法提取总RNA，测定RNA浓度及纯度后，在37 ℃环境下，逆转录酶催化下合成cDNA。在85 ℃环境下灭活逆转录酶，然后进行PCR扩增。引物序列：daf-2 mRNA上游引物5'-GTTGATAATGCTGCCGAG-3'，下游引物5'-ATCCCGGTCCGATTTCTT-3'；daf-16 mRNA上游引物5'-ATCGTGTGCTCAGAATCC-3'，下游引物：5'-ATGAATAGCTGCCCTCC-3'。扩增结束后计算扩增效率，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。每组重复3次。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组线虫不同时间点体长比较 培养1、3、6 d时，高盐组、高糖组以及高盐高糖组体长与对照组相比差异均无统计学意义（P均＞0.05）；添加10、20 mg/L黄连素后，高盐组、高糖组以及高盐高糖组体长与对应的未加药线虫相比差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组线虫培养不同时间点体长比较（n=30，pixels，）

表1 各组线虫培养不同时间点体长比较（n=30，pixels，）

组别体长培养1 d 培养3 d 培养6 d高盐组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高盐高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照正常对照组101.09 ± 2.25 101.95 ± 0.94 101.25 ± 0.99 371.90 ± 1.92 371.34 ± 0.36 371.90 ± 1.92 464.08 ± 1.87 469.07 ± 0.11 516.88 ± 1.94 100.86 ± 1.38 101.19 ± 0.73 102.50 ± 2.17 370.90 ± 0.49 371.01 ± 0.21 390.23 ± 0.81 465.55 ± 1.93 467.18 ± 0.19 519.92 ± 1.21 101.95 ± 2.43 102.34 ± 1.33 102.57 ± 2.97 101.55 ± 0.34 371.74 ± 0.69 371.56 ± 0.36 404.82 ± 1.95 349.91 ± 3.30 468.64 ± 0.71 468.31 ± 0.56 519.73 ± 0.59 435.03 ± 1.85

2.2 各组线虫不同时间点体宽比较 培养3、6 d时高盐组、高糖组以及高盐高糖组体宽均较对照组增加（P均＜0.05）；添加10、20 mg/L黄连素后，高盐组、高糖组以及高盐高糖组体宽均较对应的未加药线虫减少（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组线虫培养不同时间点体宽比较（n=30，pixels，）

表2 各组线虫培养不同时间点体宽比较（n=30，pixels，）

注：与正常对照组比较，*P均＜0.05；与同组模型对照比较，△P均＜0.05。

组别体宽培养1 d 培养3 d 培养6 d 5.22 ± 0.31 5.29 ± 0.20 5.07 ± 0.05 12.54 ± 0.26△12.42 ± 0.23△14.88 ± 0.10*高盐组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高盐高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照正常对照组17.16 ± 0.21△17.10 ± 0.12△28.00 ± 0.63*5.61 ± 0.40 5.60 ± 0.41 5.64 ± 0.76 12.34 ± 0.34△12.14 ± 0.10△16.00 ± 0.39*17.03 ± 0.19△16.81 ± 0.34△28.71 ± 0.31*19.25 ± 0.13△18.05 ± 0.04△30.42 ± 0.27*16.30 ± 0.15 5.22 ± 0.31 5.82 ± 0.43 5.00 ± 0.82 5.47 ± 0.66 14.83 ± 0.29△13.06 ± 0.05△16.44 ± 0.43*14.08 ± 0.10

2.3 各组线虫寿命比较 高盐、高糖、高盐高糖组寿命均较对照组缩短（P均＜0.01）；添加10、20 mg/L黄连素后，高盐组、高糖组以及高盐高糖组寿命均较对应的未加药线虫延长（P均＜0.01）。见表3。

表3 各组线虫寿命比较（n=30，d，）

表3 各组线虫寿命比较（n=30，d，）

注：与正常对照组比较，*P均＜0.01；与同组模型对照比较，△P均＜0.01。

寿命14.90 ± 0.41△15.77 ± 0.29△10.10 ± 0.08*15.17 ± 0.19△15.53 ± 0.52△9.03 ± 0.09*15.60 ± 0.14△15.77 ± 0.63△7.87 ± 0.24*13.53 ± 0.26组别高盐组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照高盐高糖组10 mg/L黄连素20 mg/L黄连素模型对照正常对照组

2.4 各组线虫daf-2、daf-16 mRNA表达水平比较根据上述实验结果，添加20 mg/L黄连素后，线虫体宽减小、寿命延长现象较10 mg/L黄连素更为明显，故在daf-2、daf-16 mRNA表达水平比较的实验中选择黄连素浓度为20 mg/L。与正常对照组比较，高盐组、高糖组以及高盐高糖组daf-2 mRNA表达水平降低、daf-16 mRNA表达水平升高；添加黄连素后，与对应的未加药线虫相比，daf-2 mRNA表达水平降低、daf-16 mRNA表达水平升高（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组线虫daf-2、daf-16 mRNA表达水平比较（n=30，）

表4 各组线虫daf-2、daf-16 mRNA表达水平比较（n=30，）

注：与正常对照组比较，*P均＜0.05；与同组模型对照比较，△P均＜0.05。

daf-2 mRNA daf-16 mRNA 组别高盐组20 mg/L黄连素模型对照高糖组20 mg/L黄连素模型对照高盐高糖组20 mg/L黄连素模型对照正常对照组3.10 ± 0.31△-0.02 ± 0.27*-6.94 ± 0.57△1.72 ± 0.53*2.53 ± 0.22△-2.53 ± 0.25*-6.54 ± 0.47△2.81 ± 0.63*-7.48 ± 0.98△1.37 ± 0.08*0.19 ± 0.82 2.28 ± 0.86△-2.87 ± 0.24*0.73 ± 1.28

3 讨论

儿童以及青少年处在生长发育的关键阶段，此阶段也极易发生糖盐摄入量过高的情况。高盐高糖饮食直接或通过增加体内脂肪含量间接缩短人类寿命。研究显示，腰围每增加10 cm，全因死亡风险增加11%［10］。高盐、高糖饮食可通过上调分布在肾脏皮质近端小管上皮细胞管腔侧的钠—葡萄糖协同转运蛋白（SGLTs）、降低小肠胰高血糖素样肽1表达以及抑制Min6细胞胰岛素分泌功能等多重机制促进葡萄糖和钠的重吸收，诱发血糖、血钠异常，从而导致以代谢性疾病和心血管疾病为主的诸多疾病，对人类的身体健康构成严重威胁［11-13］。除心血管疾病和代谢疾病外，高盐、高糖饮食还可以通过渗透作用诱发呼吸道疾病、抑制口腔黏膜上皮细胞增殖使其丧失抗病能力、影响人体对锌的吸收、促使慢性炎症性疾病恶化以及影响学习和记忆能力［14-15］。

中医认为，五味与五行相对应，五味中同样存在着相生相克的关系。对于咸和甘，中医认为“苦生甘”“苦克咸”，即苦味可以帮助人体更好地利用糖类物质，同时可以对抗所食过咸带来的不良影响。《素问·至真要大论》中指出“辛甘发散为阳，酸苦涌泄为阴”，意为酸味、苦味属阴，甘味属阳。以此理论为依据，我国中医内科学家仝小林院士提出“苦酸制甜法”用以调节血糖，治疗和缓解2型糖尿病。黄连最早记载于《神农本草经》，性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，其主要有效成分为黄连素。黄连素目前在临床上已被广泛应用于与盐、糖代谢相关疾病的治疗。张振等［16］以不同剂量黄连素与阿托伐他汀治疗高血压合并动脉粥样硬化，结果显示，患者血管内皮功能和血脂水平均有明显改善。黄连素在降脂方面具有广阔的治疗前景，王杨等［17］对肥胖小鼠给予黄连素治疗，发现小鼠脂肪组织纤维化明显减轻，毛螺科菌和嗜乳酸杆菌等益生菌增加，表明黄连素在降脂方面具有一定疗效，可能改善人群中因高盐高糖饮食诱发的肥胖和寿命缩短。

秀丽隐杆线虫是一种经典的模式生物，以大肠杆菌OP50为食，从受精卵发育为成虫需3.5 d，生命周期为20 d，具有遗传背景清楚、个体结构简单、生活史短的特点。秀丽线虫体内有12条信号通路与人类相同，大部分与营养代谢相关，这为以秀丽线虫为模型探讨相关药物的作用机制奠定了基础。本研究以秀丽线虫为模型，通过向L1期（孵化后14 h，以人类寿命为100年等比例计算，相当于人类3岁）线虫提供高盐高糖环境，连续观察6 d（相当于人类30岁），探讨高盐高糖对秀丽线虫生长发育的影响以及黄连素的干预作用。体长既可以代表秀丽线虫的生长发育状况，也可以反映物质的毒性，当秀丽线虫暴露于毒性物质中，体长会明显减少；秀丽线虫的脂肪主要储存于肠道及皮下，当秀丽线虫体内脂肪含量发生变化时其体宽会随之发生较为显著的改变［18］。本研究结果显示，高盐、高糖以及高盐高糖组线虫的体宽均较对照组增加，寿命均较对照组缩短；添加黄连素后，高盐、高糖以及高盐高糖组线虫的体宽有所下降，寿命有所延长；并且与10 mg/L黄连素相比较，20 mg/L黄连素作用下产生的差异更为明显。这表明黄连素可逆转高盐高糖饮食所致的秀丽线虫形态改变与寿命的缩短。

PI3K/AKT/mTOR通路是响应胰岛素信号的经典通路。食物进入小肠后，经过消化产生葡萄糖，经小肠上皮细胞吸收后使血糖增高，从而促进胰岛素释放，胰岛素进一步促进细胞对葡萄糖进行吸收和利用。胰岛素与细胞表面胰岛素受体底物1结合后，激活PI3K/AKT通路，AKT直接促进葡萄糖吸收。同时，通过AKT-TSC1/2-RheB-mTORC1通路激活mTORC1活性，mTORC1进一步促进葡萄糖的利用从而为机体正常活动提供能量。研究表明，在高糖、高脂环境培养的大鼠胰岛素瘤细胞中加入黄连素进行干预后，细胞胰岛素和胰岛素样生长因子1表达显著下降［19］。分析其机制为黄连素在高糖、高脂环境抑制胰岛素生成，从而减少机体对葡萄糖的摄取以及胰岛素抵抗的发生，缓解因葡萄糖堆积转化为脂肪而导致的肥胖。

线虫daf-2基因是唯一一个与人胰岛素受体蛋白相关基因同源的基因［20］。daf-2可促使daf-16磷酸化，阻止其进入细胞核发挥转录调节作用。daf-16是胰岛素/IGF-1信号通路中最重要的靶点，其激活可抑制线虫衰老，延长线虫寿命［21］。研究显示，肥胖可通过多种途径促进衰老，而衰老也可促进肥胖的发生和发展［22］。因此我们在机制探究中着眼于线虫胰岛素同源通路，对线虫体内daf-2、daf-16 mRNA表达进行检测，结果显示，添加黄连素后，高盐、高糖以及高盐高糖组秀丽线虫体内daf-2 mRNA表达水平较未添加黄连素线虫明显降低，daf-16 mRNA表达水平较未添加黄连素线虫明显提高。据此推测，黄连素干预高盐高糖饮食诱发的秀丽线虫形态改变以及寿命缩短的作用机制可能是黄连素抑制了秀丽线虫daf-2 mRNA表达以及提高daf-16 mRNA表达，从而减少线虫机体对葡萄糖的摄取以及胰岛素抵抗的发生，进而缓解由于过多葡萄糖转化为脂肪而导致的脂肪堆积引起的线虫形态改变，表现出抑制线虫衰老、延长线虫寿命等作用。

综上所述，高盐、高糖以及高盐高糖环境可诱发秀丽线虫体宽增加、寿命缩短；黄连素可以逆转上述变化，其作用机制与线虫胰岛素同源通路有关。后续我们将继续深入研究，为黄连素干预高盐、高糖以及高盐高糖等不良饮食嗜好导致的肥胖以及全因死亡风险增加现象提供更多证据。