文李铃 重庆市药品技术审评查验中心 （重庆 401120）

内容提要： 干扰是体外诊断系统造成测量误差的一个主要原因，特别是对基于光学原理的检测影响较大。在体外诊断试剂注册申报时，干扰研究是产品性能评价的重要组成部分，干扰的种类众多，如不同来源干扰物、试剂所采用的方法学及检测程序等。体外诊断试剂申请人应该在试剂开发过程中进行充分的干扰研究。文章介绍了可能造成干扰影响的不同因素以及在申报过程中干扰研究资料存在的主要常见问题，供体外试剂申请人参考。

干扰是体外诊断试剂使用过程中造成测量误差的一个主要原因，体外诊断试剂的干扰来源与试剂本身、所收集的样本以及检测系统对干扰的识别相关。干扰研究是试剂生产厂家在产品设计开发过程中需要完成的一项工作，干扰研究的深度和广度直接影响产品的准确度，干扰研究不充分给临床检验带来不必要的系统误差和随机误差。在国家局《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家药品监督管理局2021年第122号公告）及《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局2014年第17号通告）中明确提出了试剂申请人在提交产品注册申请时需要对产品进行干扰研究，并在说明书中明确已知的干扰物及干扰影响程度。

1.干扰的种类

干扰的种类繁多，可以来自于检测程序、检测物质和样本的来源和收集等。对于干扰研究的设计应该根据检测方法和程序的设定、被测物质特性以及对样本的要求的基础上进行系统研究，从而减少干扰对临床检测的影响。

1.1 试剂方法学带来的干扰

试剂所采用的检测方法对检测结果有一定影响，临床化学诊断试剂检测方法主要有酶法，免疫分析、化学反应等，采用不同的方法其干扰来源也不尽一致，比如血糖试剂，其葡萄糖氧化酶法和葡萄糖脱氢酶法的干扰存在很大差别，葡萄糖氧化酶对氧气敏感，易受氧气干扰，不宜长时间暴露于空气中。而葡萄糖脱氢酶不受血液或空气中氧分子的干扰，但不能区分麦芽糖、半乳糖、木糖与葡萄糖，检测时会与这些糖类发生反应，造成结果假性升高[1]。所以当血糖试剂采用葡萄糖脱氢酶法时，需要对麦芽糖、半乳糖、木糖等进行干扰研究。在肌酐检测试剂盒的研发过程中，肌酐酶法分析以肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法较为常用，但此法中肌酸对检测有干扰，试剂生产厂家需要在试剂中添加肌酸酶来排除肌酸对检测的干扰，并对肌酸的干扰进行研究。另一种检测肌酐的方法为苦味酸速率法，但此法并非对肌酐特异，还有许多化合物可生成色原性干扰物质，如蛋白质、高浓度葡萄糖、抗坏血酸、丙酮和丙氨酸等，都会对肌酐的检测带来干扰，厂家在此类产品设计开发时应尽量避免非特异性干扰[2]。

1.2 测定程序对干扰的影响

测定程序的干扰和方法学干扰紧密联系在一起，测定程序在设计开发时越充分，干扰影响越小。如前面描述的肌酐检测试剂（肌氨酸氧化酶法）中有关肌酸的干扰，厂家在试剂设计中可采用两步法，在第一步加入肌酸酶，可以消除内源性肌酸的干扰。而苦味酸中干扰物质有两类，一类为快速反应非特异性色原物质，在样品与试剂中的苦味酸混合后，可在20s内完成反应；另一种为慢速反应非特性色原物质，样品与试剂中的苦味酸混合后，一般在80～100s开始反应，所以采用苦味酸法进行肌酐检测的试剂其速率测定时间应尽量设定在苦味酸加入后20～80s进行反应[2]。

1.3 复杂多样的干扰物

1.3.1 特异性干扰（交叉反应）

交叉反应主要是存在于一些免疫分析过程中，如有与被分析物结构类似物或同源物质时，试剂中的抗体不能识别被测物质和结构类似物时，会导致检测值偏高，造成假阳性。如心肌肌钙蛋白I易对心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白C产生交叉反应。在一些体外诊断试剂检测试剂盒行业标准中，对交叉反应物质、浓度、干扰标准作出了具体规定，如人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒行业标准（YY/T 1214- 2019《人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒》）中要求对一定浓度的促卵泡生成素、促黄体生成素、促甲状腺素进行检测，确定这类物质对人绒毛膜促性腺激素的干扰。

1.3.2 内源性干扰

内源性干扰主要指所收集样本的干扰，样本的收集对检测准确性也至关重要，临床血液样本中通常会遇到溶血、脂血和黄疸样本。溶血会影响生化检测中的肝功能指标、肾功能指标、血脂指标、心肌酶指标及电解质检测结果。发生溶血主要是红细胞破裂导致血红蛋白或者其他物质释放至血浆中，待测物质浓度发生变化或释放出的某些物质与待测物质发生反应来影响待测物质的浓度，亦可通过血红素颜色干扰光学检测影响检测结果[3]。脂血样本中胆固醇和/或甘油三酯水平升高，严重脂血可导致血清或血浆因含有乳糜微粒，呈乳白色浑浊，给通过散射和比浊方法进行检测的项目带来影响。待测物质在脂血血清中分布不均匀也可能给检测带来一定的影响。黄疸标本中的胆红素为有色物质，破坏了试验原来的最佳波长的选择，造成吸光度和散射度产生较大的误差，特别是终点法影响更大[4]。

1.3.3 外源性干扰

抗凝剂的干扰：抗凝剂常用于临床检验中对人全血样本或血浆样本的处理，为血样采集后人工添加的一种物质，可避免凝血导致的干扰，也可减少溶血。抗凝剂主要有肝素、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA）、枸橼酸盐、草酸盐等。肝素抗凝剂通过抑制凝血酶活性达到抗凝效果，可影响丙酮酸氧化酶、碱性磷酸酶等的活性，从而影响该类物质检测结果的准确性。EDTA抗凝剂作为一种螯合剂，能络合血液成分中的阳离子，干扰血液样本中阳离子的浓度从而影响检测结果；使用不同种类的抗凝剂其检测结果也不尽一致，如天门冬酸氨基转移酶、癌胚抗原、铁离子、尿酸其EDTA抗凝血浆的测定值低于肝素抗凝血浆的测定值[5]。

体内药物的干扰：药物对检测结果的影响也不尽一致，应考虑临床中主要应用的常用药物的干扰。如头孢类抗生素可影响患者肌酐检验结果，且肌酐检测结果易受到药物浓度的影响；抗糖尿病类药物严重损害人体肝功能，使得人体血中葡萄糖水平降低，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶升高[6]。值得注意的是，目前生物素作为饮食中的营养补充剂被大众广泛应用，而很多免疫分析方法中生物素-链霉亲和素反应具有高敏感度、准确性和反应迅速的特点，在生物检测技术行业中被广泛应用，许多自动化免疫分析使用生物素化的抗体和链霉亲和素包被的磁珠作为固定抗原-抗体复合物的手段，进行免疫检测，过多的外源生物素可竞争结合链霉亲和素干扰反应结果，包括甲状腺、类固醇、多肽激素、肿瘤标志物的检测[7]。

综上所述，干扰的种类复杂多样，申请人应结合试剂所采用的方法学在产品设计开发时进行内源性干扰（如溶血、脂血和黄疸样本）、外源性干扰（如药物干扰和抗凝剂干扰）及特异性干扰研究，体外诊断试剂申请人可参照CLSI EP07-A2[8]、体外诊断试剂行业标准、注册技术审查指导原则等对干扰进行研究，干扰研究成果作为注册申报资料提交，需要注意的是临床评价资料中需要加入干扰样本，以验证一定浓度的干扰物质是否对检测结果造成影响。

2.注册申报资料中常见问题

虽然对于体外诊断试剂干扰研究的相关指南、行业标准及指导原则配备已比较成熟，结合重庆市体外诊断试剂注册申请人提交的注册资料，笔者认为对于干扰研究普遍存在以下问题：

2.1 干扰研究不充分，干扰物的选择太过单一

对于一般临床化学检测试剂，国内厂家干扰研究溶血、脂血和黄疸的居多，对于凝血剂或者药物干扰的研究甚少，交叉反应物质也仅限于行业标准中要求的物质及浓度。比如对于肌酐检测试剂盒已有文献报道，羟苯磺酸钙和酚磺乙胺对肌酐的测定有明显的负干扰作用[9,10]。申请人可提供这两种药物对检测结果影响的研究资料或提供此类药物对于检测结果影响的文献资料，建议将研究结果在说明书中进行说明。对于使用抗体的免疫分析而言，存在着被患者样本内嗜异性抗体所干扰的可能性。经常与动物有接触的患者，或者接受过用免疫球蛋白或免疫球蛋白碎片进行免疫治疗的患者，会产生抗体，比如：人抗小鼠抗体，样本中的人抗小鼠抗体通过在标记抗体和捕获抗体之间桥接干扰检测结果，导致假阳性，也可通过与标记抗体和捕获抗体反应，减少它们和分析物反应导致假阴性[11]。

2.2 干扰试验设计不够严谨

未提供干扰物质浓度选取依据，如内源性干扰物质浓度应覆盖人体最高浓度；药物性干扰物质应选取3～5倍人体常规浓度或最高预期浓度；企业可以根据自身产品特性结合相关指南如CLSI EP07-A2推荐浓度进行干扰试验，并合理设置浓度梯度。干扰研究时干扰物质的添加量会影响检测结果，一般不超过5%，另外还应考虑干扰物质溶剂的影响，在计算干扰率的时候应减去干扰物质溶剂的干扰。

未提供样本浓度选取依据，可以选择医学决定水平处的浓度的样本，也可以选择参考区间上限和下限浓度的样本，所选样本浓度应具有临床病理学代表意义。

干扰试验样本检测次数不具有统计学意义，不建议企业只检测1次，一般可选取3次，或者根据相关指南或行业标准等对试验次数作出规定。

未建立干扰试验接受标准，在建立干扰评估试验之前，应先确定接受标准，申请人应根据相关指南、行业标准以及技术审查指导原则确定可接受标准。可接受标准应对临床检测不产生显著影响。

2.3 干扰研究结果未在临床试验或临床评价资料中予以验证

根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家药监局2021年第72号通告）和《免于临床试验的体外诊断试剂临床评价技术指导原则》（国家药监局2021年第74号通告），需选择涵盖预期用途和干扰因素的样本进行评价研究，临床试验/评价用干扰样本应明确样本来源（包括接收采集记录）、唯一且可追溯的编号、年龄、性别、样本类型、样本临床背景信息等。

2.4 干扰研究在说明书中体现得不够具体

根据《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（原国家食品药品监督管理总局2014年第17号通告），干扰研究结果应在说明书中“检验方法的局限性”中声明。干扰声明是体外诊断试剂生产厂家对试剂盒受干扰物的影响作出的明确说明，对于说明书中的干扰声明，可以为通过企业自身研究得出的已知干扰物，也可以为通过查阅参考文献得出的可能对检测有影响的干扰因素，除了阐述已知有影响的干扰物以外，也需尽可能阐述已经证明过没有影响的干扰物。声明中要明确样本要求、干扰物的化学名称、浓度范围、用于判定有临床意义的判定标准及干扰程度（如偏差测定≤10%）。对于一些服用过特殊药物的患者和特定的人群，如儿童、孕妇等，应考虑干扰的特殊性，如有必要，应给出避免干扰的建议或措施。

3.小结

临床化学体外诊断作为普通的健康检查以及疾病筛查诊断的基础手段，其检测准确性直接影响临床医生对于疾病的判断，而干扰作为影响试剂盒检测准确性的主要因素，申请人应对其进行系统的分析研究，并在说明书中明确研究结果，给临床诊断提供可靠的信息。随着临床化学类体外诊断试剂在临床上的广泛应用，体外诊断试剂产业也在不断壮大，对该类产品的审评带来了新的挑战。本文通过介绍不同的干扰机制，干扰物质以及产品在研发过程中出现的主要问题，为从事该类产品设计开发的从业人员提供参考。