中药补骨方联合阿仑膦酸钠通过RANKL/OPG通路缓解激素性股骨头坏死

2023-08-09詹新宇李博乐张永华江长青

云南中医中药杂志 2023年7期

詹新宇李博乐张永华江长青

摘要：目的探索自拟补骨方联合阿仑膦酸钠（alendronate sodium，ALN）缓解激素性股骨头坏死的具体机制。

方法在前期临床研究基础上，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立激素性股骨头坏死家兔模型，经中西药联合干预后，研究激素性股骨头坏死模型兔的骨组织结构、病理、细胞凋亡以及股骨头坏死分子标志物的变化。

结果自拟补骨方联合西药ALN改善股骨头坏死状态，并降低凋亡细胞的百分比。同时，自拟补骨方西药联合给药下调破骨细胞分化因子（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的表达，上调模型兔中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨保护素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）表达，降低RANKL/OPG比值。

结论自拟补骨方联合西药ALN通过下调RANKL/OPG途径在预防LPS诱导的股骨头坏死方面显示出协同作用。

关键词：股骨头坏死；中药补骨方；阿仑膦酸钠；类固醇激素；RANKL/OPG通路

中图分类号：R681.8

文献标志码：B

文章编号：1007-2349（2023）07-0001-03

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常见疾病类型之一，最主要症状为局部股骨头发炎、髋关节疼痛且活动受限，严重影响患者的生活质量。ONFH根据病因不同可以分为创伤性和非创伤性。创伤性ONFH主要是由严重外部创伤引起的，其病因和发病机制是明确的；然而，非创伤性ONFH主要是由激素、酒精及代谢性疾病引起，造成股骨头内部血液供应异常，最终导致股骨头中的活骨坏死［1-2］。类固醇激素引起的股骨头坏死是非创伤性ONFH的最常见形式，占所有ONFH病例的30～50％。ONFH多发于20～50岁的中青年，且其发病率趋于年轻化［3］。ONFH严重影响了人们的健康，针对ONFH的治疗尤为迫切。目前，多种西藥已被应用于ONFH的临床治疗，例如抗凝血药和血管扩张剂、降脂药、双膦酸盐类等；临床研究证实双膦酸盐类药物能预防股骨头的破坏和变形，其中阿仑膦酸钠有防止广泛塌陷的骨头继续塌陷的潜能［4］。然而目前临床上对于西药治疗ONFH的用药时机、剂量等问题仍缺乏相关的系统研究，且存在着靶向性低，易产生副作用等缺点。传统中药在中国已经使用了数千年，具有许多优点，如多靶点、全身调节、副作用小和价格低廉。近年来大量研究证明中药能减轻骨坏死程度、有效延缓ONFH的进程［5］。之前的研究证明补骨方在ONFH中显示出良好的临床疗效［6］，但其在ONFH中的功能和机制却鲜为人知。在这项研究中，笔者建立了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ONFH兔模型，并研究了补骨方联合阿仑膦酸钠在LPS诱导的ONFH中的作用和机制。

1 资料与方法

1.1 动物模型构建新西兰大白兔共20只，年龄8周，体重约2.5 kg，雄性，按照标准饲养条件饲养，自由饮食、饮水。实验白兔购于江苏集萃药康生物科技有限公司。待实验白兔适应性喂养1周后，精确称重，随机选取5只作为空白对照组，其余15只作为模型组。模型组动物经耳缘静脉注射10 μg/kg脂多糖，24 h后于右侧臀部肌肉注射醋酸泼尼松龙20 mg/kg，连续注射3 d，每次间隔24 h。空白对照组注射同等剂量的生理盐水，不注射脂多糖和醋酸泼尼松龙。为预防感染，动物每周2次肌肉注射青霉素钠，每次每只5万单位。造模6周后，通过对比空白对照组动物和模型组动物的进食量、毛色状况、体重、注射部位病变程度、精神状态评价造模是否成功。然后随机选取1只对照组和3只模型组动物采集股骨固定并进行HE染色。此次研究中所有动物实验均已经过当地伦理会审批通过。

1.2 给药方式将造模成功的剩余12只动物随机分为三组，每组4只，即模型组、西药组、补骨方+西药组。西药组为阿仑膦酸钠（alendronate sodium，ALN，北京万生药业），按照150 μg/kg·d-1进行灌胃；补骨方+西药联合给药组为阿仑膦酸钠加上自拟补骨方。中药补骨方由12种中草药组成，包括血竭、龙胆、川芎、党参、紫草、白术、牛膝、红花、金银花、麦冬、没药和甘草。将总重100 g草药浸入1，000 mL水中，煮沸浓缩至250～300 mL。中药剂量按兔子体重计算，使用前先将药物稀释于生理盐水，按照25 g/ kg·d-1进行灌胃，对照组用等量的生理盐水进行灌胃，共治疗四周。

1.3 临床观察观察对比各组动物的进食量、毛色状况、体重、注射部位病变程度、精神状态、死亡率。

1.4 HE染色白兔股骨组织置于多聚甲醛中固定后，用乙醇逐级脱水，经浸蜡、包埋后，制成4 μm组织切片，苏木素染色7 min、伊红染色1 min后在显微镜（Olympus，日本）下观察。

1.5 TUNEL染色使用细胞凋亡检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）检测细胞凋亡率。组织切片用100 μL浓度为20 μg/mL的Proteinase K溶液室温孵育20 min；再用100 μL1×Equilibration Buffer室温孵育10 min；随后加入TdT，37℃避光孵育60 min；最后滴加DAPI避光孵育5 min，然后在荧光显微镜（Olympus，日本）下观察采集图像。

1.6 RT-qPCR检测取100 mg组织，加入1 mL Trizol提取总RNA；通过Oligo引物利用逆转录酶反转录生成cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增，进行基因表达量分析。靶基因的相对表达量通过 2-ΔΔCt法分析；GAPDH作为内参；PCR反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40循环；PCR反应引物序列如表1。

1.7 Western blotting 检测用EDTA脱钙液对股骨标本进行脱钙；随后利用RIPA裂解液冰上提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后电泳跑胶（分离胶浓度为8%，蛋白上样量为40 μg），转膜；加入RANKL（1∶500；Bs-20624R，Bioss）和OPG（1∶500；Bs-2064R，Bioss）一抗，4℃过夜孵育；然后再加入辣根过氧化物酶耦联二抗（1∶2，000；BA1054，博士德生物科技有限公司，武汉），37 ℃孵育1 h；最后显影、拍摄，利用Image J软件（Rockville，USA）处理图像，测定灰度值。

1.8 统计学方法所有结果以均值 ± 标准差的形式呈现，多组间比较采用单因素方差分析，2组之间比较采用t检验。数据统计分析和作图软件为GraphPad prism 7（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）。P<0.05和P<0.01为显著性差异和极显著性差异的筛选标准。

2 结果

2.1 临床观察结果实验过程中，对照组动物进食正常、毛色正常、体重增加，无异常。模型组动物进食减少、毛色干枯杂乱、体重下降、注射部位出现浮肿、行动不便。建模一周后，模型组动物右爪逐渐出现溃烂现象，空白对照组动物右爪无变化。模型組动物与对照组相比，进食量明显下降，精神状态较萎靡，体重下降，毛发不光亮。与模型组相比，补骨方联合ALN给药后进食量有所增加，精神状态渐渐转好。体重较模型组有所回升，毛色逐渐恢复光亮。实验过程中所有动物均未死亡。

2.2 组织病理学检查结果取白兔股骨组织进行HE染色。如图1所示，对照组软骨细胞排列均匀，细胞核呈圆形，形态正常，骨髓腔细胞正常，骨小梁完整，破骨细胞较少。模型组动物软骨细胞损伤排列杂乱，细胞核固缩，骨小梁断裂消失，骨髓腔细胞胞质颜色溶解着色变浅，细胞核固缩，破骨细胞增多。与模型组比较，ALN给药后动物软骨细胞轻微杂乱，骨小梁溶解较为明显，骨髓腔细胞较少，着色较浅，细胞形态较差；补骨方与ALN组软骨细胞排列较均匀，破骨细胞减少，骨髓腔细胞着色较正常，骨小梁略有溶解。这些结果说明模型组白兔出现了明显的股骨损伤；ALN延缓了股骨坏死进程，而补骨方与ALN联合给药展现出更好的疗效。

2.3 补骨方联合ALN对白兔股骨组织ALP含量的影响 ALP是成骨细胞早期分化的标志物，其含量变化如图2所示。与对照组相比，模型组中ALP含量明显下降（P<0.01）；与模型组相比，ALN处理后，ALP含量有所上升（P<0.01）；与西药组相比，补骨方联合ALN处理组ALP含量上升趋势更明显（P<0.01）。在ONFH模型兔中，骨代谢活性明显下降；ALN单独处理改善了骨代谢活性；而补骨方ALN联合给药对改善骨代谢活性的效果更加显著。

2.4 补骨方联合ALN对白兔股骨细胞凋亡的影响 TUNEL染色法检查细胞凋亡率，结果如图3所示。与对照组相比，ONFH模型兔中凋亡细胞数量明显上升（P<0.01）；ALN有效降低了细胞凋亡率（P<0.01）；与西药组相比，补骨方ALN联合给药展现出更好的疗效（P<0.01）。在ONFH兔中股骨细胞凋亡增多，补骨方联合ALN有效抑制了细胞凋亡。

2.5 补骨方联合ALN对白兔股骨组织中RANKL、OPG基因mRNA及蛋白表达的影响如图4所示，与空白对照组相比，模型组白兔股骨组织中RANKL基因和蛋白表达量均明显上调，OPG基因和蛋白表达显著下调（P<0.01；图4A、B、D），RANKL/OPG比值增加（P<0.01；图4C）；ALN处理后，与模型组相比，RANKL基因表达含量下降，而OPG基因表达含量上升，RANKL/OPG比值降低（P<0.01；图4A-C），并且RANKL蛋白表达量下降，OPG蛋白表达量上升（P<0.01；图4D）；与西药单独处理相比，补骨方联合ALN联合处理效果更加明显（P<0.01）。RANKL及OPG的含量变化说明补骨方联合ALN通过下调RANKL/OPG抑制ONFH进程。

3 讨论

类固醇通过一系列的信号通路介导成骨细胞凋亡和破骨细胞分化，从而打破了骨形成和骨吸收的动态平衡，并导致ONFH［7］。类固醇-ONFH在临床工作中经常出现，可导致高度致残。因此，开发新的药物或疗法来治疗和预防类固醇-ONFH迫在眉睫。目前针对ONFH的治疗主要包括手术治疗和非手术治疗（物理治疗、药物治疗等）［4］。中药或天然提取物是药物治疗ONFH中一种有效手段，与其他类型的药物相比，具有高效和低毒等特点［8］。在之前的临床研究中，我们发现补骨方联合ALN对激素性ONFH有一定作用［6］。本研究探究了补骨方对及激素性ONFH的抑制作用和机理。研究表明，在LPS诱导的兔ONFH模型中，股骨头中成骨细胞的数量减少、骨组织中细胞凋亡数量增多，联合使用ALN以及补骨方药物可以使坏骨恢复并降低细胞凋亡率。LPS诱导RANKL的表达并抑制OPG的表达。联合使用ALN加补骨方可以下调RANKL/OPG通路。

中医学中，股骨头坏死属于“骨痹”和“骨蚀”范畴，其基本病机为血瘀阻络、精不生髓［9］。中药补骨方由十二种中草药组成，包括血竭、龙胆、川芎、党参、紫草、白术、牛膝、红花、金银花、麦冬、没药和甘草。此药方中血竭、龙胆、川芎能够活血行气、祛风止痛且抗菌消炎，改善血液循环，保证骨组织的营养供应；党参、白术燥湿健脾、益气养血、补裨益不足；牛膝中的三萜类化合物能减轻激素引起的成骨细胞抑制和骨细胞凋亡引起的成骨障碍；红花、没药具有活血止痛的作用；紫草、金银花、麦冬能够清热解毒；甘草调和药物且缓急止痛［10］。ALN是一种用于治疗ONFH的西药，它能够增加骨密度、抑制骨溶解，有效抑制股骨头坏死。本次研究证实补骨方联合ALN处理减少了LPS诱导的ONFH中的破骨细胞数量，改善了股骨细胞形态，有效降低了股骨头坏死。ALP是一种普遍存在于成骨细胞内的胞内酶，骨代谢旺盛时，ALP活性增强［11］。本次研究结果显示，使用自拟补骨方和ALN联合处理后，坏死骨组织中细胞凋亡率降低且ALP含量明显上升；这说明补骨方ALN联合处理改善了ONFH模型兔股骨坏死状态，减缓了ONFH进程。RANKL/OPG是评价骨健康与调节骨吸收平衡的重要指标，其增加则促进成骨细胞凋亡，使骨形成延迟。OPG能抑制破骨细胞分化和活性，维持骨代谢平衡［12］。牛膝提取物对类固醇诱导的OPG下调和RANKL上调具有拮抗作用，并且对预防类固醇诱导的ONFH有好处［13］。本研究结果显示，补骨方联合ALN通过上调OPG表达和下调RANKL表达以降低RANKL/OPG比值，进一步增强了ALN对LPS诱导的ONFH的疗效。

这项研究表明，补骨方ALN联合处理可以通过下调RANKL/OPG通路来加速坏死骨的修复并改善LPS诱导的ONFH的发展进程，对LPS诱发的ONFH具有一定缓解作用。

参考文献：

［1］许灿宏，陈跃平，章晓云.成骨信号通路在非创伤性股骨头坏死中的作用［J］.中国组织工程研究，2020，24（14）：2235-2242.

［2］谭文志，王国强，王建忠.中药治疗早中期股骨头坏死的应用进展［J］.医学综述，2022，28（1）：157-162.

［3］齐琳，任忠陆.中药治疗股骨头坏死的作用机制研究进展［J］.中国药物经济学，2022，17（1）：121-124.

［4］张昌攀，谢庆华，张丰毅.非手术治疗非创伤性股骨头坏死的临床研究进展［J］.风湿病与关节炎，2020，9（10）：76-80.

［5］黄荣兰，胡文彬，詹庆昊.中医药通过调控骨代谢相关信号通路治疗股骨头坏死的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2021，27（8）：241-250.

［6］詹新宇.自拟补骨方联合阿伦磷酸钠治疗非创伤性股骨头坏死临床疗效观察［J］.中医药临床杂志，2019，31（8）：1568-1571.

［7］孙飞，彭昊.激素性股骨头坏死病理机制中细胞凋亡的研究进展［J］.骨科，2022，13（1）：86-91.

［8］康锦文，杜志峰，于國胜.中医疗法治疗非创伤性股骨头缺血性坏死临床进展［J］.中医研究，2022，35（2）：66-70.

［9］郑敦辉，李国湘，符方涛.四妙消肿方联合西药治疗早期股骨头坏死的疗效及对髋关节功能的影响［J］.四川中医，2022，40（4）：158-161.

［10］崔小东.中药补骨方对骨质疏松性股骨粗隆间骨折外固定术后骨质代谢的影响［J］.北方药学，2020，17（5）：131-132.