李 杨, 徐 曼, 潘妙霞, 陈剑妹, 王玉川, 蔡兴莉

中南大学湘雅医学院附属海口医院 肾病风湿科,海南 海口 570208

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)为糖尿病的并发症之一,严重影响患者预后[1]。DN病理改变的重要特征为系膜细胞增殖,肾小球系膜的细胞外基质堆积、基底膜增厚、系膜区扩张,从而发展为肾小球硬化[2-4]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)为长度>200 bp的转录本,且不具有任何明显的蛋白质编码能力[5]。LncRNAs可以影响不同的细胞功能,参与多种生理和病理过程[6-11]。长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(long non-coding RNAs growth arrest-specific transcript 5,LncRNA GAS5)可通过与Yes关联蛋白结合,促进其磷酸化和降解,从而抑制结直肠癌的进展[12]。LncRNA GAS5在DN患者的血清中表达下调,并参与DN进展[13]。本研究旨在探讨LncRNA GAS5在DN进展中的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料及分组 5周龄大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司;人肾小球系膜细胞(human mesangial cell,HMC)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;TRIzol RNA试剂购自Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq GC试剂盒购自TAKARA公司;Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司;双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司;沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)、GAPDH抗体购自Abcam公司;细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)试剂购自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 体外DN模型构建 肾小球系膜细胞于高糖(25 mmol/L)Dulbecco改良Eagle培养基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)中培养,模拟建立DN细胞模型,分为LncRNA GAS5干扰组、LncRNA GAS5过表达组与阴性对照组。

1.2.2 外泌体的分离鉴定、摄取实验 收集细胞上层清液,去除杂质与细胞碎片后于滤器中(0.22 μmol/L)过滤,在电镜铜网上涂20 μl外泌体悬液,于室温条件下放置10 min,采用30 μl磷钨酸(20 mg/ml)复染1 min,于透射电镜下观察、拍照记录。

1.2.3 RNA提取及实时荧光定量聚合酶链式反应检测 利用TRIzol提取总RNA,采用分光光度计检测RNA浓度。利……