姜兆婷,张甲,王琪,贺晨卉,刘昕,周钰奇,王博,坚哲

白癜风是一种常见的表皮/黏膜黑素细胞丢失引起的色素脱失性皮肤病,其具体机制尚不明确,缺乏理想的动物模型制约着白癜风研究。目前建立的动物模型主要包括转基因小鼠模型、自身免疫诱导的小鼠模型和化学试剂诱导的小鼠模型等。其中,以莫诺苯宗为代表的化学试剂诱导的白癜风样小鼠模型具有造模周期短、组织病理学特征与人白癜风相似度高等优点,逐渐受到研究者们的青睐。莫诺苯宗是临床常用的脱色剂,可引起接触部位及远处非接触部位色素脱失[1]。Zhu等[2]以莫诺苯宗诱导构建的白癜风样小鼠模型,其涂抹与非涂抹部位可见毛发黑素含量减少及CD8+T细胞浸润,与人白癜风具有一定的相似性。然而,C57BL/6小鼠黑素细胞主要存在于毛囊中,表皮中并无黑素细胞分布,因此尚不能完全模拟人白癜风的发病特点,此外该模型诱导时间长,停止涂药后白毛复色较快,极大限制了此种模型的应用。

维甲酸是一种维生素A的衍生物,可作为弱效脱色剂使用[3]。Kasraee 等[4]研究表明,莫诺苯宗联合维甲酸应用于豚鼠10 d,涂抹部位即可出现脱色,黑素细胞数量也显著减少。因此,本研究分析对比了40% 莫诺苯宗联合0.1%维甲酸乳膏对C57BL/6和 SCF转基因小鼠的脱色效果及脱色部位的病理特点。

1 材料与方法

1.1实验动物 C57BL/6小鼠6周,雌性,购买于空军军医大学动物实验中心,SCF转基因小鼠6周,雌性,购买于美国杰克逊实验室。

1.2主要仪器和试剂 莫诺苯宗(麦克林公司);乳膏基质(广州博新);DMSO(Sigma公司,美国);0.1% 维甲酸(迪维);黑色素染色试剂盒(贝索企业);大鼠抗小鼠CD8(Abcam公司);兔抗小鼠CD49b(Abcam公司);兔抗小鼠DCT(Abcam公司);小鼠抗小鼠8-OHdG(Sata Cruz Biotechnology);激光共聚焦显微镜(美国蔡司公司);病理切片机(德国莱卡公司);HE全自动染色机(德国莱卡公司);倒置光学显微镜(德国莱卡公司);数字病理切片扫描仪(德国莱卡公司)。

1.3方法

1.3.1实验动物分组 C57BL/6小鼠15只,随机分为三组,分别为对照组(Control)3只,莫诺苯宗组(MBEH)6只,莫诺苯宗联合维甲酸组(MBEH+RA)6只;SCF转基因小鼠15只,分组同上。

1.3.2造模 小鼠背部取约2 cm×2 cm皮肤备皮,对照组除备皮外不予任何处理,莫诺苯宗组涂抹40%莫诺苯宗乳膏50 mg,联合组涂抹40%莫诺苯宗乳膏50 mg、0.1%维甲酸乳膏20 mg,3 d 1次,共涂抹30 d。

1.3.3皮肤脱色观察及评估 于3、7、14、21、28 d肉眼观察小鼠毛发、皮肤颜色变化并拍照,进行积分记录。将小鼠脱色部位分为用药部位和非用药部位,每个部位总分5分。脱色面积评分标准为:0分为无脱色;1分为脱色面积0～10%;2分为脱色面积11%～25%;3分脱色面积26%～50%;4分为脱色面积51%～75%;5分为脱色面积76%～100%[2]。

1.3.4组织病理 于背部白斑明显时(C57BL/6小鼠第14天,SCF转基因小鼠第10天)取皮肤,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片后分别进行HE染色,免疫组织化学染色,黑色素染色,免疫荧光染色。HE染色:脱蜡水化,苏木素伊红染色,中性树脂封片;免疫组织化学染色:切片进行脱蜡和抗原修复,一抗为CD8(1∶200)、CD49b(1∶500),二抗为山羊抗兔/大鼠IgG-HRP,DAB显色树胶封片;黑色素染色:切片脱蜡,分别进行硫酸亚铁、铁氰化钾醋酸液、Van Gieson染色处理,树胶封片;以上切片使用数字病理切片扫描仪对切片进行扫描及数据分析。免疫荧光染色:切片脱蜡及抗原修复,一抗(CD8 1∶200;DCT 1∶1 000;NK 1∶500;8-OHdG 1∶50),相应的荧光二抗(1∶400)避光孵育,含Hoechest的封片剂封片,通过激光共聚焦显微镜采集图像。

2 结果

2.1莫诺苯宗联合维甲酸可有效诱导两种小鼠皮肤脱色 联合组C57BL/6小鼠涂抹部位第7天可见毛发根部变白,14 d涂抹部位出现明显白毛,非涂抹部位可见少许白毛,第21天与第30天仅观察到少量白毛,考虑可能是此时小鼠未处于毛发生长期,毛发未完全长出,莫诺苯宗组涂抹部位第9天出现白毛,脱色发生时间较联合组晚(t=3.13,P<0.01)。联合组与莫诺苯宗组均于第25天开始复色(表1～2),有新生黑色毛发长出,两组复色开始时间差异无统计学意义(t=1.11,P=0.29)。联合组SCF小鼠涂抹部位第3天即出现白斑,非涂抹部位可见少许白斑,第14天白斑最为显著,可见白毛;莫诺苯宗组涂抹部位第9天开始出现白毛,脱色发生时间较联合组晚(t=7.93,P<0.000 1)。联合组第14天开始复色,莫诺苯宗组第13天开始复色(表1～2),两组复色开始时间比较,差异无统计学意义(t=0.86,P=0.41),见图1。

The skin depigmentation of mice; The extent of monobenzone induced depigmentation on C57BL/6 mice; The extent of monobenzone combined with retinoic acid induced depigmentation on C57BL/6 mice; The extent of monobenzone induced depigmentation on SCF transgenic mice; The extent of monobenzone combined with retinoic acid induced depigmentation on SCF transgenic mice图1 莫诺苯宗联合维甲酸对C57BL/6小鼠和SCF转基因小鼠的皮肤脱色情况Fig.1 The skin depigmentation of monobenzone combined with retinoic acid on C57BL/6 mice and SCF mine

表1 两种小鼠用药部位出现脱色的时间比较Tab.1 Comparison of the depigmentation time in the two mice strains

表2 两种小鼠用药部位出现复色的时间比较Tab.2 Comparison of the repigmentation time in the two mice strains

2.2白癜风样小鼠脱色部位黑素细胞及黑素含量显著减少 C57BL/6小鼠对照组及联合组表皮均未见DCT+细胞,考虑可能是其背部皮肤中黑素细胞含量极少所致;SCF转基因鼠对照组白斑处表皮层可见大量DCT+黑素细胞,联合组表皮DCT+细胞数量显著减少,提示黑素细胞丢失(图2a)。黑色素染色结果显示,联合组SCF鼠表皮黑素含量较对照组显著减少,联合组C57BL/6小鼠毛囊中黑素含量较对照组显著减少,提示毛囊黑素细胞丢失(图2b)。以上结果表明,莫诺苯宗联合维甲酸可诱导黑素细胞丢失,从而导致皮肤脱色。

Immunofluorescence staining of DCT (×200); Melanin staining (×400)图2 脱色部位黑素细胞和黑素减少Fig.2 Melanocyte and melanin reduced in the depigmentation site

2.3白癜风样小鼠脱色部位可见CD8+T细胞浸润 HE染色结果显示,联合组C57BL/6与SCF小鼠脱色部位真皮浅层可见少至中量淋巴细胞浸润,而对照组未见浸润(图3a)。免疫荧光与免疫组织化学结果进一步表明,联合组C57BL/6与SCF脱色部位表皮基底层与真皮浅层可见CD8+T细胞浸润,而对照组未见浸润(图3b～c)。结果表明,莫诺苯宗联合维甲酸可通过诱导CD8+T细胞浸润增多,从而杀伤黑素细胞,导致皮肤脱色。

HE staining (×400); Immunofluorescence staining of CD8 (×200); Immunohistochemistry staining of CD8 (×400)图3 脱色部位可见CD8+T细胞浸润Fig.3 CD8+T cell infiltration at the depigmentation site

2.4白癜风样小鼠脱色部位可见NK细胞浸润 联合组C57BL/6与SCF小鼠脱色部位可见少量CD49b+的NK细胞浸润(图4a～b),主要分布在真皮浅层及中层,而对照组未见浸润。综上,莫诺苯宗联合维甲酸可能也可通过诱导NK细胞诱导皮肤脱色。

Immunofluorescence staining of CD49b (×200); Immunohistochemistry staining of CD49b (×400)图4 脱色部位可见NK细胞浸润Fig.4 NK cell infiltration at the depigmentation site

2.5两种小鼠脱色部位氧化应激水平升高 脱色部位皮肤免疫荧光结果显示,联合组C57BL/6与SCF小鼠8-OHdG水平显著高于对照组(图5),表明莫诺苯宗联合维甲酸可诱导小鼠脱色部位氧化应激水平增高。

图5 脱色部位氧化应激水平升高 (Immunofluorescence staining of 8-OHdG×200)Fig.5 The oxidative stress level increased at the depigmentation site (Immunofluorescence staining of 8-OHdG×200)

3 讨论

莫诺苯宗是一种常用的皮肤脱色剂,长期接触可引起健康个体罹患白癜风[5]。研究表明,莫诺苯宗与酪氨酸酶作用可形成醌-半抗原,一方面诱导黑素小体自噬和酪氨酸酶泛素化,增强黑素细胞的免疫原性,另一方面激活NLRP3炎症小体,启动NK细胞介导的先天免疫反应,加速白斑形成;同时,莫诺苯宗还可诱导活性氧生成,促进黑素细胞分泌含有相关抗原的外泌体,增强局部免疫应答;上述过程相互作用激活半抗原特异性CD8+T细胞对黑素细胞的杀伤[6-7]。维甲酸可通过损伤黑素细胞的谷胱甘肽依赖性防御机制[8]、降低黑色素生成活性[9],增加黑素细胞对莫诺苯宗的敏感性,增强莫诺苯宗诱导的细胞毒性和脱色作用,发挥协同脱色效果。本研究发现,莫诺苯宗联合维甲酸应用于C57BL/6小鼠,涂药部位在1周左右即出现白毛,非涂药部位2周左右出现白毛,组织病理显示表皮轻度增生,毛囊色素显著减少,这与Zhu等[2]单独使用莫诺苯宗构建的白癜风样小鼠模型相比,造模时间进一步缩短。表皮富含黑素细胞的SCF转基因鼠在涂药3天即可见到明显的皮肤脱色,组织病理显示表皮轻度增生,黑素细胞数目及表皮黑色素含量显著较少,但是该模型需要不断涂药维持,否则易出现复色。

CD8+T细胞介导的黑素细胞杀伤是白癜风发病的关键效应环节[10-11]。本研究发现,莫诺苯宗联合维甲酸应用于C57BL/6及SCF转基因小鼠,真皮浅层均可见CD8+T细胞浸润,与人类白癜风皮损处CD8+T细胞浸润特点一致,符合人类白癜风的免疫反应过程。Tulic等[12]研究显示,白癜风患者血清中NK细胞增加,通过分泌IFN-γ启动CD8+T细胞介导的适应性免疫应答。本研究发现,在C57BL/6及SCF转基因小鼠中联合应用莫诺苯宗和维甲酸,皮损局部真皮浅层可见较多NK细胞浸润,这与van den Boorn等[13]报道一致,提示莫诺苯宗联合维甲酸可启动NK细胞介导的先天免疫反应。

氧化应激是白癜风发生和建立持续自身免疫反应的主要原因之一[10, 14]。本课题组之前的研究发现,非节段型白癜风患者血清中DNA氧化损伤副产物8-OHdG水平高于健康对照,血清中8-OHdG水平与疾病活动性和严重程度相关[15]。在本研究发现莫诺苯宗联合维甲酸涂抹小鼠背部后,局部8-OHdG水平显著升高,表明莫诺苯宗联合维甲酸可增加皮肤局部的氧化应激水平,进一步激活自身免疫反应。

综上所述,本研究证明莫诺苯宗联合维甲酸可在两种小鼠中诱导脱色反应。这种脱色作用主要通过诱发局部氧化应激,激活NK细胞,进一步活化CD8+T细胞,介导黑素细胞损伤而实现。由于野生型C57BL/6小鼠黑素细胞主要存在于毛发中,皮肤中含量极少,尚不能完全模拟人白癜风的发病特点。因此,基于表皮富含黑素细胞的SCF转基因鼠构建的白癜风样动物模型可作为研究白癜风发病机制、探索治疗靶点和评判疗效的备选模型。