刘飞飞 韩丽君 申友奎 陶开亮

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是指因外界暴力直接或间接地作用于头部而引起的颅脑外伤性病变[1]。因TBI 易并发感染、肢体运动功能障碍、脑神经功能障碍、全身脏器功能障碍等并发症，在我国TBI 的死亡率高达7%[2]。随着对TBI 病理及生理机制研究的不断深入，促红细胞生成素、前列环素、孕酮和生酮饮食等被用于TBI 的临床研究，但能通过Ⅲ期临床试验的药物仍较少。因此，开发高效的治疗药物是当前TBI 研究的重点。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、免疫调节和神经保护等多种药理活性。研究表明，白藜芦醇可以降低TBI 大鼠脑内肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β 的表达，抑制神经元自噬，减少神经元凋亡，减轻脑水肿，有助于细胞的修复和神经功能的恢复[3]。此外，白藜芦醇还可以通过抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB 通路、抑制炎症因子释放等途径来发挥神经保护作用[4]。为了进一步探讨白藜芦醇治疗TBI 的具体作用机制，本研究借助网络药理学方法筛选白藜芦醇治疗TBI 的可能作用靶点，并采用分子对接技术进行靶点验证，以期为TBI的治疗与白藜芦醇的临床应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 白藜芦醇作用靶点获取 检索TCMSP[5]、BATMAN-TCM[6]、Drugbank[7]、SuperPred[8]、PharmMapper[9]和SwissTargetPrediction[10]数据库，获取白藜芦醇作用靶点577 个。

1.2 TBI 相关靶点收集 以“traumatic brain injury”“brain injury, traumatic”“trauma, brain”“intracranial trauma”“craniocerebral trauma”“brain trauma”“encephalopathy, traumatic”为关键词，分别检索TTD[11]、Drugbank、CTD[12]、GeneCards[13]、OMIM[14]和Malacards[15]数据库，获取TBI 相关靶点9 231 个。选取其中相关度＞20 的靶点，最终获得TBI 相关靶点1 100 个。

1.3 药物-靶点-疾病网络的构建 将TBI 相关靶点与白藜芦醇作用靶点上传至UniProt 数据库[16]，再转换成相对应的基因名称，筛选经过验证的人源基因作为有效作用靶基因，共得到白藜芦醇治疗TBI 作用靶点165 个。利用Bioinformatics 网站构建韦恩图，交集靶点即白藜芦醇治疗TBI 的作用靶点。将上述作用靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建药物-靶点-疾病网络。

1.4 蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）构建 将交集靶点导入STRING 数据库[17]构建PPI。设置蛋白种类为“homo sapiens”，最低相互作用阈值为“medium confidence（0.40）”，隐藏无关联的靶点，其他参数设为默认值。采用Cytoscape 3.8.0 软件“Network Analysis”功能计算蛋白节点的度值、综合得分、介数等重要网络拓扑参数。应用CytoHubba 插件基于最大团中心性（maximal clique centrality，MCC）算法来确定PPI 排名前10 的节点作为核心靶点。应用MCODE 插件对PPI 进行聚类分析，根据节点数及k-core 值选取功能模块。

1.5 生物学过程与信号通路富集分析 分别将MCODE 1～5 模块和165 个交集靶点导入Metascape数据库[18]，species 设置为“homo sapiens”，在“Custom Analysis”中选择基因本体论（gene ontology，GO）进行生物学过程富集分析，主要包括生物过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular functions，MF）、细胞组分（cellular components，CC）等，选择京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行信号通路富集分析。设定阈值P＜0.05，并根据P 值对分析结果进行排序，筛选具有显著差异的生物学过程和信号通路（前20 个条目）。采用Cytoscape 3.8.0 软件构建药物-靶点-KEGG 通路网络，绘制Bioinformatics 和ImageGP网站可视化绘图。

1.6 白藜芦醇与核心靶点的分子对接 从ZINC 数据库[19]下载白藜芦醇的3D 结构（保存为Mol2 格式），作为分子对接中的活性小分子；从RCSB PDB数据库[20]下载核心靶点的蛋白结构。采用Pymol 2.4.0 软件对蛋白进行去水、移除原配体、加氢等操作（保存为PDB 格式）。利用AutoDockTools 1.5.6 软件进行半柔性对接，取打分最高的构象，用Pymol 2.4.0 将对接结果进行可视化处理，DiscoveryStudio 2020 进行相互作用分析。

2 结果

2.1 药物-靶点-疾病网络分析 白藜芦醇治疗TBI 的药物- 靶点- 疾病网络涉及1 514 节点和1 677 条边，提示白藜芦醇可能通过多种靶点作用于TBI，见图1（插页）。

图1 白藜芦醇治疗TBI 的药物-靶点-疾病网络

2.2 PPI 分析 所构建的PPI 包含165 个节点和3672 条边，提示各靶点相互关联，通过相互协调对TBI 发挥作用，见图2（插页）。功能模块分析得到节点≥4、k-core≥3 的5 个功能模块，见图3（插页）。PPI 排名前10 的节点分别是胰岛素（insulin，INS）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）1、TNF、TP53、白蛋白（albumin，ALB）、IL-6、SRC、信号转导和转录活化因子（signal transducer and transcription activator，STAT）3、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9，均包含在MCODE 1 中，可能是白藜芦醇治疗TBI 的核心靶点。

图2 白藜芦醇治疗TBI 的PPI

图3 白藜芦醇治疗TBI 的功能模块分析

2.3 GO 和KEGG 富集分析 MCODE 1～5 的GO富集分析显示，BP 主要涉及细胞迁移的调控、上皮细胞增殖、氧化应激反应、细胞因子介导的信号通路、星形胶质细胞分化等；MF 主要涉及激酶结合、细胞因子受体结合、转录因子结合、G 蛋白偶联受体结合等；CC 主要涉及膜筏、细胞间连接、树突、囊泡腔、神经元胞体、突触前等。MCODE 1～5 的KEGG富集分析显示，信号通路主要涉及AGEs-RAGE 信号通路、内分泌抵抗、HIF-1 信号通路、JAK-STAT信号通路、胰岛素抵抗、神经活性配体-受体相互作用、癌症途径、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触等，见图4（插页）。交集靶点的GO 富集分析显示，BP 主要涉及转移酶活性的正调控、细胞迁移的积极调控、活性氧代谢过程、对受伤的反应、内皮细胞增殖等；MF 主要涉及激酶结合、蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶结合、细胞因子受体结合、蛋白酶结合、转录因子结合等；CC 主要涉及膜筏、囊泡腔、突触后膜、树突、内质网腔、细胞间连接等。交集靶点的KEGG富集分析显示，信号通路主要涉及癌症途径、AGEs-RAGE 信号通路、FoxO 信号通路、补体与凝血级联等，见图5（插页）。

图4 MCODE 1～5 的GO 和KEGG 富集分析

图5 交集靶点的GO 和KEGG 富集分析（A：GO 分析；B：KEGG 分析）

2.4 药物-靶点-KEGG 通路网络分析 药物-靶点-KEGG 通路网络包含186 个节点和734 条边，见图6（插页），提示白藜芦醇的作用靶点分布于不同通路，通过多靶点作用于多条通路来参与TBI 的疾病进程。

图6 药物-靶点-KEGG 通路网络

2.5 白藜芦醇与核心靶点的分子对接 分子对接结果显示，白藜芦醇与IL-6、INS、MMP-9、SRC、TNF、ALB、IGF1、STAT3、TP53、VEGFA 等10 个核心靶点成功对接，其中白藜芦醇与IL-6、MMP-9、INS、SRC 的对接结合能＜-5 kJ/mol，表现出较好的结合可能性。白藜芦醇可以与IL-6 中的氨基酸残基LEU65、GLU173 形成氢键，与PRO66、LEU166、MET68 残基之间形成疏水相互作用；与MMP-9 关键残基LEU418 之间形成氢键，与ARG424、GLU416之间形成疏水相互作用；与INS 之间形成4 个氢键，包括CYS7、CYS6、CYS11 和SER9，与LEU11、ALA14、LEU16 和LEU13 残基之间形成疏水相互作用；与SRC 在GLU342、MET344 残基之间形成氢键，与LEU396、VAL284、ALA296 和LEU276 之间形成疏水相互作用。

3 讨论

有文献报道白藜芦醇的生物利用度和类药性值较低[21]。但是美国食品药品监督管理局已批准白藜芦醇作为抗癌剂或抗氧化剂用于临床治疗，这表明白藜芦醇具有可药性。本研基于网络药理学研究，共筛选出10 个白藜芦醇治疗TBI 的核心靶点，分别为INS、IGF1、TNF、TP53、ALB、IL-6、SRC、STAT3、VEGFA 和MMP-9。分子对接结果显示，白藜芦醇与10个核心靶点均能成功结合，其中白藜芦醇与IL-6、MMP-9、INS、SRC 蛋白具有较好的结合活性。INS 可以降低一氧化氮、活性氧和TNF-α 的产生，进而降低TBI 患者的感染率、改善神经功能预后[22-23]。IGF1能够促进神经元的生长和分化，在中枢神经系统损伤后的修复和神经再生中起着重要作用[24]。TNF 是重要的免疫调节和炎症因子，参与TBI 后炎症反应等过程[25]。TP53 在控制细胞周期、引发细胞凋亡过程中发挥重要调节作用，还参与DNA 损伤后的修复。ALB 具有蛋白质转运、清除自由基等功能，是重要的细胞外抗氧化剂。IL-6 在TBI 后炎症反应、免疫应答及神经创伤修复等方面起着重要作用。TBI后小胶质细胞以IL-6 依赖的方式来促进神经修复[26]。SRC 激活会加重TBI 发生后的血脑屏障破坏和脑水肿[27]。STAT3 参与TBI 后的JAK-STAT 信号通路，促进IL-6、TNF 等炎症因子的表达。VEGFA和MMP-9 通过破坏血脑屏障，诱导神经元凋亡和炎症反应等，从而加重TBI[28-29]。

GO 和KEGG 富集分析发现，白藜芦醇可能作用于机体的多种CC，以不同的反应方式参与多种BP，其所涉及的信号通路主要包括AGEs-RAGE 信号通路、FoxO 信号通路、胰岛素抵抗、补体和凝血级联、HIF-1 信号通路、钙离子信号通路和JAK-STAT信号通路等。RAGE 分布于神经元细胞和胶质细胞等部位，与AGEs 特异性结合后介导细胞内氧化应激、NF-κB 通路激活等，从而导致神经血管损伤、神经细胞凋亡[30]。TBI 后脑组织内的FoxO 表达上调，FoxO 信号通路通过调控神经细胞自噬，以减轻神经损伤[31]。有学者发现，白藜芦醇能通过调控FoxO 信号通路来抑制TNF-α、IL-1β 释放和促进抗凋亡因子Bcl-2 的释放，从而减轻脑缺血再灌注损伤[32]。胰岛素与受体结合所介导的MAPK 通路和PI3K 通路参与TBI 后应激反应。胰岛素抵抗可加重TBI 后乳酸酸中毒、钙离子超载，进而加重脑水肿和神经损伤[33]。在脑内补体系统和凝血级联相互作用，补体系统可以激活凝血级联途径产生凝血酶，而凝血级联途径中的凝血酶、血清素等还能激活补体级联途径。因此，补体和凝血级联途径交叉作用，协同调节TBI后的凝血-纤溶平衡和免疫反应等[34]。TBI 后HIF-1信号通路具有双向调节作用，既可以通过诱导VEGF 表达，促进红细胞增殖及新生血管形成，增加神经细胞耐受[35]；又可以通过介导细胞凋亡及炎症反应，导致神经细胞死亡[36]。研究发现，白藜芦醇可以通过HIF-1 信号通路来影响血脑屏障的通透性，进一步验证了本研究预测结果的可靠性[37]。TBI 发生时，细胞内钙离子浓度急骤增加，造成钙离子超载，进而导致神经细胞水肿、凋亡[38]。钙离子超载还存在于微血管内皮细胞，破坏血脑屏障完整性，加剧TBI 后血管源性脑水肿的发生。TBI 后脑组织内JAK-STAT信号通路激活，会加重血脑屏障破坏及神经损伤[39]。由此可见，本研究预测的信号通路均与TBI 关系密切，表明白藜芦醇治疗TBI 涉及多条信号通路。

综上所述，白藜芦醇可能通过多靶点、多通路发挥减轻TBI 和促进神经功能恢复的治疗作用，其中IL-6、MMP-9、INS、SRC 可能是白藜芦醇治疗TBI的核心靶点，AGEs-RAGE、FoxO、胰岛素抵抗、补体和凝血级联、HIF-1、钙离子和JAK-STAT 等是藜芦醇治疗TBI 涉及的主要信号通路。