刘颖 马春华 朱彧

肺腺癌是中国目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]。肺腺癌患者预后不良的主要原因是局部复发或远处转移，脑膜转移（leptomeningeal metastasis，LM）为肺腺癌细胞侵犯硬脑膜、软脑膜、脑脊液及蛛网膜下腔等部位，一般脑和脊髓内并无瘤块，是肺腺癌患者最严重的中枢神经系统（central nervous system，CNS）并发症，可发生在肺癌治疗的任何阶段且为术后的唯一复发病灶，其明确诊断仅约5%。LM 预后极差，积极治疗仅将生存期从6～8 周延长至3～11 个月，约15%的患者可长期生存1 年以上，极大威胁了患者的生命，对其家庭和社会也造成沉重的负担[2]。

目前已经公认脑脊液与中枢神经系统转移瘤具有紧密联系[3]，因此国内外针对脑脊液标本开展了多种脑膜转移瘤诊断技术的研究，如脑脊液循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、脑脊液循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、脑脊液免疫细胞化学检测、蛋白芯片以及流式细胞术等[4-5]。但目前传统脑膜转移瘤诊断技术存在缺乏客观指标、敏感性、特异性以及诊断效能低、操作方法复杂、对标本保存处理条件以及诊断医师经验要求高等不足。蛋白组学技术是近年来基于质谱技术发展起来的检测肿瘤标志物的新技术，本研究拟通过蛋白组学技术从脑脊液蛋白质组变化中发现肺腺癌脑膜转移的差异蛋白，证实通过脑脊液辅助诊断肺腺癌脑膜转移的可行性，为脑脊液诊断技术方法学研究提供理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2019 年1 月至2021 年12 月天津市环湖医院经确诊的肺腺癌脑膜转移患者30 例作为试验组，来自同期非炎症性神经系统疾病患者30 例作为对照组。试验组中男性11 例，女性19 例，年龄57.2±11.5 岁；对照组中男性15 例，女性15 例，年龄63.7±14.8 岁。两组基线资料比较无显著性差异（年龄：χ2=1.900 0，P=0.062 5；性别：χ2=1.086 2，P=0.297 4）。标本的采集经天津市环湖医院伦理委员会批准和患者本人或家属的知情同意（伦理批件编号：2019-42）。

入组标准：1）经组织学或细胞学明确诊断的肺腺癌患者。2）确诊的LM 患者。3）MRI 检查颅内无直径超过l cm 的转移病灶。4）6 个月内无脑炎及颅脑外伤病史，未经过脑部手术或者放疗。5）经脱水药物治疗后颅内高压症状可获得控制。6）能够耐受腰椎穿刺采集脑脊液。7）排除合并颅内脑膜瘤、室管膜瘤、脊膜瘤等脑脊髓膜病变[6]。

诊断标准：按照中国LM 专家共识诊断标准：1）具有1 个或多个典型LM 症征。2）恶性肿瘤病史或神经系统症征出现后发现肿瘤。3）具有1 个或多个辅助检查发现，如颅压升高、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）蛋白升高、糖降低，影像学示脑膜强化，CSF 存在循环肿瘤DNA。4）确诊实验：CSF 细胞学找到癌细胞或CSF 肿瘤标志物阳性。5）排除其他诊断，同时满足上述5 项条件即确诊LM[2]。

1.2 方法

1.2.1 脑脊液样本收集及处理 所有患者均行侧卧位腰椎穿刺，颅内压无升高或降低，椎管无阻塞。取无色清亮脑脊液5 mL，立即经4℃，2 000×g 离心10 min，取上清于−80℃冰箱冻存 。

1.2.2 脑脊液蛋白质组的检测 肽段制备：将脑脊液样本经BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0012S）检测蛋白浓度后，取500 ng蛋白转移至10 KD 蛋白组超滤管中，通过200 μL 1 mol/L 尿素置换样本，向超滤管中加入酶解液（酶∶蛋白=1∶50），调至pH 为8.0，37℃消化16 h，离心收集消化肽段样本，旋转蒸干，通过C18 脱盐柱脱盐，通过高pH 值反向色谱柱分析样本。2）质谱上样：液相色谱-串联质谱LC-MS/MS 设备采用Q Exactive HF质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），自制C18 色谱分析柱（内径150 μm，粒径1.9 μm，长度12 cm），柱温维持在30℃，上样500 ng。LC-MS/MS条件：流动相A：1%甲酸，99%水；流动相B：1%甲酸，99%乙腈，流速0.6 μL/min。在初始条件下（0%流动相B）平衡15 min 后，0～5 min 5%流动相B（100%乙腈，0.1%甲酸）；6～16 min 10%流动相B；17～51 min，22%流动相B；52～71 min，30% 流动相B；72 min，95%流动相B；78 min，95% 流动相B。3）蛋白质鉴定：通过Uniprot 数据库和Proteome Discoverer 软件进行蛋白质检索和鉴定，设定差异倍数为1.2 倍或0.83 倍，且P<0.05 作为表达上调或下调的显著阈值，多肽和蛋白质的假发现率（false discovery rate，FDR）设置为0.01，达到可信度>99% 。

1.2.3 酶联免疫吸附试验 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法按照说明书要求通过酶标仪Multiskan FC（美国Thermo Fisher Scientific 公司）分析脑脊液蛋白组学分析中差异蛋白含量，C1q（ab170246）、C2（ab 154132）、C7（ab125964）、C8B（ab283548）、C9（ab13 7972）、AMBP（ab108884）、CFI（ab195460）、SERPIN F1（ab213815）。ELISA 试剂盒购自美国Abcam 公司，KRT1（CSB-EL012503HU）、SAA4（CSB-EL020659 HU）、KRT6A（CSB-EL012561HU）、ACTG1（CSB-EL0 01222HU）、SERPINF2（CSB-E09452h）、LPA（CSB-EQ 028005HU）ELISA 试剂盒购自美国CUSABIO 公司，PGLYRP2 ELISA 试剂盒购自美国Biomatik 公司（EKU06521）。采用德国SIMENS BNⅡ特种蛋白分析仪通过速率散射比浊试验分析脑脊液IgG 含量（OSAS15），采用美国贝克曼库尔特AU5800 全自动生化分析仪通过免疫透射比浊试验分析脑脊液载脂蛋白B 含量（OSR6143）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0 软件进行统计学分析，连续变量采用表示，组间差异比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验，组间多重比较采用LSDt检验。使用Cytoscape 3.8 软件进行基因本体论（gene ontolgy，GO）分析。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LC-MS/MS 鉴定结果

LC-MS/MS 结果经Uniprot 数据库和Proteome Discoverer 软件进行蛋白质检索和鉴定，共鉴定出蛋白372 个，与对照组比较，试验组脑脊液中13 个蛋白显著上调，6 个蛋白显著下调（表1）。

表1 肺腺癌脑膜转移患者脑脊液差异蛋白变化

2.2 生物信息学分析

本研究通过GO 富集分析，研究了肺腺癌脑膜转移患者脑脊液差异蛋白相关的生物学过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component，CC）分布，其中急性炎症应答（acute inflammatory response）和创伤应答（response to wounding）是富集差异蛋白较多（分别占44%和22%）的生物学过程（图1A），细胞外膜结合细胞器（extracellular membrane-bounded organelle）、细胞外外泌体（extracellular exosome）和细胞外囊泡（extracellular vesicle）等细胞组成分布发生了改变（图1B）。通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）网络分析差异蛋白之间的关系，发现肺腺癌脑膜转移患者脑脊液差异蛋白主要与急性炎症应答、体液免疫应答（humoral immune response）和应激反应调控（regulation of response to stress）相关（图1C）。

图1 肺腺癌脑膜转移患者脑脊液差异蛋白GO 富集分析

2.3 脑脊液差异蛋白的验证

本研究通过ELISA 试验研究了试验组和对照组患者脑脊液中上述差异蛋白的变化，发现与对照组相比，试验组脑脊液中补体C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 显著上调（均P<0.05），未能在脑脊液中检测到ApoB、KRT1/6A、ACTG1、SERPINF1/2和LPA（表2）。

表2 肺腺癌脑膜转移患者脑脊液蛋白含量变化（n=30）

2.4 脑脊液差异蛋白的检验效能

通过ROC 分析得到补体C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 的诊断效能（表3），其中C2 具有较高的特异度，PGLYRP2 具有较高的灵敏度，将二者进行二元Logistic 回归分析，得到Logistic（P）=3.758× C2+0.213×PGLYRP2-49.103，ROC 分析表明C2+PGLYRP2 联合分析可得到较为理想的诊断效能。

表3 脑脊液蛋白辅助诊断肺腺癌脑膜转移的检验效能

3 讨论

肺腺癌脑膜转移患者出现临床症状时其疾病发展已不可控制，因此肺腺癌脑膜转移的早期发现和早期治疗是改善患者预后的关键[7]。但是，早期诊断脑膜转移癌尚属医学难题，即便脑脊液细胞学检查、磁共振成像增强扫描等现有诊断“金标准”也存在灵敏度和特异度较低，只能定性不能定量等缺陷，己成为肺癌脑膜转移早期治疗的一个瓶颈[8-10]。

蛋白组学技术被认为是检测蛋白质谱的最有效的手段，本研究通过蛋白组学技术有望从脑脊液蛋白质组变化中发现肺腺癌脑膜转移的差异蛋白，从而实现肺腺癌脑膜转移的早期预警和诊断，为挽救患者生命赢得时间。

已有研究证实，脑脊液免疫状态可表征脑转移瘤微环境[11]。肿瘤细胞侵犯神经系统，可激活免疫细胞并促进免疫细胞增殖和细胞因子分泌，因此监控脑脊液免疫状态可反映肿瘤脑膜转移情况[12-13]。补体系统是一类可调节人体细胞和体液免疫的调节蛋白，在免疫系统和防御机制中具有重要的作用。神经系统中的补体系统不但可参与免疫系统调控，还可参与突触和神经细胞发育调控。

本研究采用非标记定量LC-MS/MS 技术观察到肺腺癌脑膜转移患者脑脊液蛋白质组表达发生了改变。生物学过程分析表明，患者脑脊液差异蛋白主要分布于急性炎症应答、创伤应答和外部刺激应答等生物学过程，而细胞外基质、膜结合细胞器、外泌体和囊泡等细胞组成富集也发生了显著改变。细胞组成分析结果提示肺腺癌侵犯脑膜的过程中，脑脊液中免疫相关蛋白谱发生了显著变化，补体系统受到激活，KEGG 分析结果提示肺腺癌脑膜转移过程中出现了急性炎症应答、体液免疫应答和应激反应。为了证实蛋白组学分析结果，本研究通过ELISA 和生化法考察了肺腺癌脑膜转移患者脑脊液中差异蛋白的表达，发现补体患者脑脊液中C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 显著上调，但是未能在脑脊液中检测到ApoB、KRT1/6A、ACTG1、SERPINF1/2和LPA，可能与ELISA和生化法试剂盒灵敏度低于质谱法有关。PGLYRP2与抗肿瘤免疫反应有关，补体C1q/2/7/8B、IgG、SAA4和AMBP 均与急性炎症反应有关，表明脑膜转移患者出现了炎症应答，证实了KEGG 分析结果。上述研究结果与Kwon 等[14]的研究结果相一致，但其未对差异蛋白的诊断价值进行探索。

本研究为了进一步探讨差异蛋白在肺腺癌脑膜转移临床诊断中的作用，ROC 分析发现，PGLYRP2具有较高的灵敏度，补体C2 具有较高的特异度，补体C2 与PGLYRP2 联合分析具有较为理想的诊断效能，具有成为肺腺癌脑膜转移诊断标志物组合的潜力。本课题组曾通过免疫FISH 技术检测肺癌脑膜转移患者脑脊液中循环肿瘤细胞[6]，其AUC 为0.875、灵敏度为75.0%、特异度为100.0%，其AUC 和灵敏度低于本研究结果，特异度高于本研究结果。本研究有望通过监测脑脊液中补体系统活化状态为肺腺癌脑膜转移提供预测手段并为肿瘤免疫治疗提供新的策略。