徐志强，熊文，冯俊俏，牛云蔚

（1.烟草化学安徽省重点实验室,安徽合肥 230088）（2.云南中烟工业有限责任公司，云南昆明 650231）（3.焦甜香生物科技有限公司，安徽芜湖 241000）（4.上海应用技术大学香料香精化妆品学部，上海 201418）

春黄菊是菊科草本植物，原产于欧洲中部，现我国的西北、东北、西南等地均有种植[1]。春黄菊有三种不同产地的品种，包括德国春黄菊、罗马春黄菊、摩洛哥春黄菊。根据产地的不同，不同的春黄菊中化学成分含量有很大差异，其中，德国春黄菊中挥发油含量要高于罗马春黄菊，罗马春黄菊中挥发油主要成分为当归酸和惕各酸的脂肪族酯，而德国春黄菊油主要成分为没药醇及其氧化物。罗马洋甘菊具有抗氧化、抗高血压、抗菌、抗炎、催奶等作用[2-5]，其挥发油对抑郁症、牙周炎有较好的效果[6,7]。而德国春黄菊在欧洲用得较广，被称为欧洲的万灵药。它具有杀菌和杀真菌、催眠，助消化，缓解关节肿痛等作用[8,9]。

目前，对春黄菊干花的生物特性、药学性能的研究较多，关于春黄菊干花和精油香气成分的报道相对较少，且多集中于罗马春黄菊精油挥发性成分组成分析[10,11]，而对于德国春黄菊的挥发性成分研究基本没有。李斌等[12]采用GC-MS技术，分析洋甘菊花精油成分，主要含有母菊薁，母菊素，反式-β-法尼烯，α-甜没药萜醇及其氧化物，双环吉马烯，香芹酮等。韩松林[13]采用GC测定，以红没药醇为对照品，测定洋甘菊花精油含红没药醇衍生物（红没药醇氧化物，红没药醇氧化物A，红没药醇氧化物B，红没药醇）质量分数约0.01%~0.04%。

气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），应用于医学、物理学，气相色谱的流动相为惰性气体，其主要原理为气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相，当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，从而达到分离各组分的功效。气相色谱-嗅闻技术（GC-O）是将嗅觉和仪器检测结合起来的分析技术，将经过前处理的样品注入到连有气味检测仪的色谱柱中，通过FID或MS检测器检测样品的化学组成，获得样品的化学组成和气味特征信息。

实验通过GC-MS分析鉴定了德国春黄菊干花中的挥发性香气成分，并结合GC-O香气强度法研究了对春黄菊整体香气贡献较大的香气物质为(E)-β-金合欢烯、乙酸和甜没药烯萜醇氧化物B，确定了关键香气成分戊酸和癸酸乙酯，结论为春黄菊的应用提供理论依据，进一步提升春黄菊相关食品的生产应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

春黄菊样品产地，安徽省宣城市杨柳镇；2-辛醇、乙醇、正构烷烃（C7~C30），Sigma-Aldrich西格马奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

GC7890-MS5973气-质联用仪，美国Agilent公司；固相微萃取纤维涂层（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美国Supelco公司；ODP-2嗅闻仪，德国Gerstel公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品准备

称取1 g包含春黄菊干花的花柄和花瓣的样品加入试剂瓶中，再用移液器吸取100 μL内标2-辛醇（内标，40 mg/L）。

1.3.2 顶空固相微萃取（HS-SPME）

将萃取头在250 ℃老化20 min，以确保其在吸附之前没有残留物。将 1 g春黄菊和 100 μL 2-辛醇（40 mg/L，内标）放于20 mL顶空瓶中。然后，将顶空瓶置于 50 ℃恒温水浴锅中。将萃取头置于样品的顶部空间吸附30 min（距离样品表面上方约1 cm），结束后，插入GC-MS进样口，解析5 min，利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行分析。

1.3.3 GC-MS分析

GC条件：DB-5非极性色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气流速：2 mL/min；载气：氦气；升温程序：维持 6 min的初始温度 40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，维持20 min；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流。

MS条件：电子轰击能量：70 eV；采用EI电离源；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；接口温度：250 ℃；全扫描范围：30~350m/z。

1.3.4 GC-O

GC-O在配备有嗅觉检测端口Gerstel ODP-2的Agilent 7890气相色谱（GC）上进行。GC流出物在氢离子火焰检测器（FID）和嗅闻口之间以1:1的比例分开。载气（氢气）的流速为2 mL/min。柱箱温度从40 ℃（6 min），3 ℃/min 升至 100 ℃，然后以 5 ℃/min升温至230 ℃（20 min），喷射器和FID温度分别设定在250 ℃和280 ℃。潮湿空气以50 mL/min的速度进入嗅闻口，为专业的嗅闻小组成员提供舒适感。

由来自上海应用技术大学香料香精化妆品学部的3名的专业人员，感知并记录香气化合物的保留时间、香气强度以及香气描述。实验运用“时间强度法”以0~10分的十分制来评定香气强度：“0”表示无；“2”表示香气强度较弱；“4”表示香气强度弱；“5”表示香气强度中等；“7”表示香气强度强；“9”表示香气强度非常强。每人嗅闻3次，最后记录的香气强度采用嗅闻人员的平均值。

1.3.5 香气活力值（OAV）

对各香气物质定量后，根据参考文献[14]中的气味阈值，计算OAV，见公式（1）。

式中：

C——香气化合物的浓度；

OT——香气阈值[15]。

利用 OAV值评估挥发性化合物对春黄菊样品风味特征的重要性，当OAV≥1时，则该组分被认为对整体香气有重要贡献。

1.3.6 S曲线法

利用Origin软件，根据S曲线方程（公式2）进行拟合。当嗅觉检测概率为0.5时，对应的是待测组分的检测阈值[16-22]。二元混合物的理论检测概率使用Feller加合模型，如香气化合物A和香气化合物组成的二元混合物，混合后的理论检测概率根据Feller加合公式（公式 3）计算得到，当实验阈值与理论阈值的比值R＞1时，则表现出掩盖作用；当R=1时，则为折中作用，当I＞R＞0.5时，则为加成作用；当R≤0.5时，则为协同作用。

式中：

P——嗅觉检测概率；

t——待测组分的嗅觉阈值；

x——待测组分的浓度对数值；

P——校后的嗅觉检测概率；

D——每种待测组分的参数特征，即函数的陡度。

P(AB)——检测混合物的理论嗅觉检测概率；

P(A)——香气化合物A的嗅觉检测概率；

P(B)——香气化合物B的嗅觉检测概率。

1.3.7 电子鼻

采用配备MXT-5（10 m×0.18 mm×0.4 μm，美国）MXT-1701（10 m×0.18 mm×0.4 μm，Restek，美国）色谱柱的Alpha M.O.S HERACLES II电子鼻（AlphaMO，法国）直接将称量好的混合样品进行静态顶空分析。

1.3.8 感官分析

样品的评估使用九分制（0=无，9=极强）。首先，小组成员收集春黄菊的描述性术语；其次，小组成员讨论不同的感官属性标准，并选择了有关春黄菊的五种香韵描述词（花香、青香、药香、木香和果香）找到 10名相关专业的研究生进行进一步的定量描述分析，由实验人员在旁记录结果并确定各个香韵的香气强度标准。

1.3.9 数据分析

采用Microsoft Excel 2016版本进行原始数据处理，Origin 2021进行分析及作图。

2 结果与讨论

2.1 春黄菊香气成分的定性定量分析

参照李爱萍等[23]的研究方法用气相-质谱仪对杭白菊花水的香气成分进行分析。对春黄菊进行了GC-MS与GC-O分析，通过质谱、RI值、香气特征对其进行了鉴定，一共检测出53种挥发性香气成分，其中酯类13种，醛类6种，醇类8种，酸类6种，酮类2种，烯烃类11种，其它类7种。表1为通过GC-MS与GC-O分析获得的香气化合物的浓度、香气特征。由表1可知，主要香气化合物是(E)-β-金合欢烯（6.06 mg/L），乙酸（4.61 mg/L），甜没药烯萜醇氧化物B（1.12 mg/L）和癸酸乙酯（0.75 mg/L）。

表1 春黄菊干花香气成分、含量及OAVTable 1 Aroma components, content and OAV of dried Chamomile

香气化合物的含量不是评价其在样品中贡献的唯一标准，往往还要参考它们的香气阈值。根据Guth获得的结果，OAV大于1的香气化合物被认为有助于样品的香气。根据HS-SPME-GC-MS的定性、定量结果，并用查找到的对应阈值计算其OAV值，由表2可知，计算出有18种香气化合物OAV＞1.00，其中酯类8种、酸类6种、醛类2种、醇类1种、醚类1种。8种酯类化合物分别为癸酸乙酯、癸酸甲酯、苯甲酸甲酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、壬酸乙酯，酯类化合物虽然数量最多，但是其浓度却占12.00%，是春黄菊中第三大种类的物质，其中癸酸乙酯OAV值最大（622.43），表现为果香、脂蜡香、甜香；6种酸类化合物分别为戊酸、乙酸、己酸、异戊酸、2-甲基丁酸、丙酸，值得注意的是，酸类化合物虽然只有6种化合物，但其浓度却占29.77%，是酯类化合物含量的两倍，是春黄菊中第二大种类的物质，其中戊酸OAV值最大（1 096.01），表现为酸臭味，其他酸类的OAV值也都大于5，对春黄菊香气有很大贡献；2种醛类化合物分别为苯甲醛、壬醛，它们主要贡献于青香、脂蜡香、花果香；醇类化合物是桉叶油醇，表现为药草香；醚类化合物是玫瑰醚，表现为花香。徐晓俞[24]等对杭白菊花水香气成分进行分析，实验数据得到的酯类、烯烃类、酮类相对含量较高，而本次实验中鉴定出酸类成分比较高，推测可能是因为本次实验的研究对象是干花，与空气接触时间较长。当然，这些成分的共同作用构成了春黄菊干花的浓郁香气[25]。

戊酸、癸酸乙酯、乙酸的OAV在样品中大于150，因此被认为是春黄菊中主要的香气化合物，其中戊酸

是样品中 OAV值最高的香气化合物，对春黄菊的酸香有很大贡献。有7种化合物的OAV值在10~150之间，如癸酸甲酯、苯甲酸甲酯、己酸乙酯、己酸。它们主要贡献于果香、甜香、花香、酒香和酸香，可能促进春黄菊整体香气的和谐。比如钱海峰[26]实验中菊花样品的己酸乙酯含量略低于本实验，所以春黄菊样品的果香尤为突出；郭双[27]对四种菊花进行分析，其中所有样品的(E)-β-金合欢烯均远低于本实验春黄菊样品的含量，因(E)-β-金合欢烯的香气描述为药草香、木香和甜香，所以本实验样品在药草香、木香和甜香中均有体现；其中苯甲酸甲酯含量为0.06 mg/L，香气强度为4.98，不被认为是重要的香气化合物，但是由于其极低的阈值，导致 OAV值较高，对春黄菊的香气有很大贡献。本实验数据显示春黄菊样品中芳樟醇的含量略高于薛建[28]对野扇花的香气分析实验的数据，所以样品在花香的感官中非常明显。

续表1

2.2 感官描述性分析

实验中对春黄菊进行感官评价，并对“花香”、“果香”、“甜香”、“青香”、“酸香”、“木香”和“药草香”7个香韵指标进行综合打分，春黄菊的感官分析结果如表2和图1所示。香韵得分最高的是花香香韵，其次是酸香、果香香韵，青香强度较弱，感官分析结果与春黄菊的香气特征是一致的。花香香韵可能与酯类、醚类和醇类香气物质有关，酸香与酸类香气物质有关。

表2 春黄菊干花感官分析结果Table 2 Sensory analysis results of dried chamomile

图1 春黄菊的香气轮廓Fig.1 The aroma profile of Chanmomile

滕云[29]测得用无溶剂微波萃取法提取野菊花精油中的桉油烯醇同本实验测得的含量相差不多，但本实验数据显示春黄菊样品中樟脑、石竹烯这些具有药草香、木香、青香香气的化合物比潘芸芸[30]等测定四种食用菊花中的含量都略低，且其测得的四种食用菊花中所含有的主要相同成分1,8-桉叶油素、α-蒎烯等，这些具有药草香青、香香气的化合物本实验都没有测得，肖作兵[31]等对7个厂家的菊花精油中桉叶油醇测得得数据也比本实验略高。故样品在药草香的感官中不是特别突出。

除感官评价外，还对春黄菊干花样品进行了电子鼻分析，如图2所示，这两个图分别表示由两个不同极性的毛细管柱（包括MXT-5和MXT-1701）和两个FID检测到的香气化合物的轮廓。建立了春黄菊干花的风味指纹图谱，为今后的生产提供理论基础。

图2 春黄菊的电子鼻分析Fig.2 Electronic nose analysis of Chamomile

2.3 S型曲线法

根据春黄菊香气成分中OAV和GC-O测定结果，并结合感官分析，选择己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯4种酯类香气化合物和乙酸、戊酸2种酸类香气化合物进行研究，采用S型曲线法探究不同结构香气成分之间的相互作用关系，总结春黄菊主要香韵的香气成分之间协同效应的关系。

为了更好地深入研究果香和酸香香气成分之间的相互作用关系，根据Feller添加模型将获得的数据与计算的理论值进行比较从而评估每个酯类物质对于混合物香气的影响。通过S曲线法确定酯类和酸类物质的香气阈值（结果见图3和表3）。如表3所示，己酸乙酯和苯甲酸甲酯的香气阈值为0.47和22.76 mg/L，辛酸乙酯和癸酸乙酯的香气阈值为71.90和2.53 mg/L，乙酸和戊酸的香气阈值为63.02和0.02 mg/L。且由表格中可以看出，拟合方程的回归系数都是大于0.90，说明S型曲线拟合效果好。

表3 酯类和酸类混合物理论阈值与实测阈值Table 3 Theoretical and measured thresholds for mixtures of esters and acids

图3 2种酸类和4种酯类的阈值S曲线图Fig.3 Threshold S-curves of two acids and four esters

测定酯类和酸类混合物的阈值按照混合物中下香气化合物在春黄菊中实际浓度比例混合。从表3中可以看出，酸香和果香香气成分组合时，原有香气物质的阈值都发生了改变，即两个香气物质混合后的实测阈值和理论阈值存在偏差，结果表明这些香气物质混合时，发生了相互作用。香气物质间的相互作用通过试验阈值与理论阈值的比值判定，该比值为R，R＞1，表现为掩盖作用；R=1，无作用；0.5＜R＜1，加成作用；R≤0.5，协同作用[32]。

从上面的研究内容可以看出，S型曲线法综合了香气成分的阈值、浓度等因素的相互作用，弥补了阈值法的局限性[33]。通过S曲线法和Feller添加模型得出的辛酸乙酯和乙酸混合物的实际香气阈值和理论香气阈值为71.895 2和63.020 2 mg/kg（见图3和表3）。辛酸乙酯和乙酸混合物的实际阈值与其理论阈值的比值为0.48。辛酸乙酯和乙酸有明显的协同作用。实验测试了关键酯类化合物和酸类化合物的八组二元混合物（图4和表3）。根据表3，八对二元混合物的实验检测概率，几乎占一半以上（62.5%），低于Feller添加模型计算得出的理论值，由此得出这八对混合物具有掩盖效果。这些混合物是乙酸和苯甲酸甲酯，乙酸和己酸乙酯，戊酸和苯甲酸甲酯，戊酸和己酸乙酯，戊酸和辛酸乙酯。其中，朱建才[34]通过S型曲线法、OAV法、σ-τ图法也发现乙酸和己酸乙酯有强烈的掩盖作用。此外，2对混合物的实验检测概率大于使用Feller添加模型计算的值，揭示了加成作用效果。这些混合物是乙酸和癸酸乙酯，戊酸和癸酸乙酯。由此可以看出，癸酸乙酯可能和酸香具有加成作用。因香气成分之间存在着复杂的协同、掩盖和加成等作用[35]，从S型曲线法的总体结果看出，果香和酸香的香气成分之间更容易表现出掩盖作用，这个结论与朱建才[34]通过S曲线、香韵主导性研究得到的结论相似，果香和酸香之间发生的掩盖作用也让春黄菊的酸香香气比较柔和，使得春黄菊整体香气丰富但又协调。

图4 S曲线法分析8组混合物质香气协同Fig.4 S-curve method to analyze aroma synergy of 8 groups of mixed substances

3 结论

通过对春黄菊干花样品进行GC-MS与GC-O分析，共鉴定出53种挥发性物质，包括酯类（13种）、萜烯类（11种）、醇类（8种）、醛类（6种）、酸类（6种）、酮类（2种）和其他类（7种），萜烯类香气物质是春黄菊样品挥发物中含量最大的化学组分（42.68%）。而通过GC-O和OAV实验得出，春黄菊样品的主要香气化合物是(E)-β-金合欢烯（6.06 mg/L），乙酸（4.61 mg/L），甜没药烯萜醇氧化物B（1.12 mg/L）和癸酸乙酯（0.75 mg/L）。根据HS-SPME-GC-MS的定性、定量结果发现，OAV＞1.00的香气化合物有18种，包括酯类（8种）、酸类（6种）、醛类（2种）、醇类（1种）和醚类（1种）。

根据春黄菊香气成分中GC-MS和GC-O测定结果，选择己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯4种酯类香气化合物和乙酸、戊酸2种酸类香气化合物进行研究，采用S曲线法评估了两类化合物之间的相互作用。结果表明，乙酸与苯甲酸甲酯和己酸乙酯发生掩盖作用，与辛酸乙酯发生协同作用，与癸酸乙酯发生加成作用；而戊酸除与癸酸乙酯发生加成作用外，与其他物质均发生掩盖作用。综上春黄菊在日常生活中可用于日化品、食品、酒类和烟草调香中[36]。