郭欣，郭楠，蔡云朗，徐延华

(1.济南市妇幼保健院 妇科，山东 济南 250000； 2.山东省第一医科大学附属省立医院 药学部，山东 济南 250000； 3.东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，因早期症状不易被发现，多数患者就诊时已处于晚期[1]。尽管目前抗血管生成药物及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly[ADP-ribose]polymerase,PARP)抑制剂在卵巢癌的治疗中已处于一线地位，但紫杉醇联合铂类的方案仍是治疗基石。对于无PARP基因突变的患者，临床治疗仍以化疗为主。紫杉醇联合铂类药物的化疗方式使得卵巢癌患者的5年生存率接近50%，在有效治疗后仍有约70%的患者复发，且复发瘤表现出较强的耐药性。肿瘤组织中的肿瘤干细胞在肿瘤的增殖、侵袭、复发、耐药等过程中发挥着重要作用[2-3]。本课题组前期通过中空介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica nanoparticles,HMSN)设计的HMSN-COOH@DOXfluorescence NVP包载阿霉素(doxorubicin,DOX)及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)特异性的阻断剂NVP-AEW541，可有效逆转卵巢癌干细胞的耐药性，促进其凋亡，抑制其增殖[4]。但前期实验均在二维平面上进行，为进一步检测此复合载药系统的化疗效果，本研究设计了三维细胞培养模型，此培养平台上的细胞形态及微环境更接近体内真实状态，药物、营养物质和气体扩散属性更接近于活体组织，并且可以与相邻细胞建立更为紧密的联系，同时也可更为精确地预测动物实验和临床实验的结果。

1972年，研究者们就已经开始探究细胞在平面及具备黏附功能的三维立体结构中的生长差异[5]。Bissell的研究强调了三维细胞培养在创建精准体外模型中的重要作用，并使三维细胞培养的理念及其独特的仿生性等优势被认同[6]。构建三维细胞仿生模型的宗旨即为使得单个细胞可维持正常的三维形状，具备同在体相似的分化、接受及传递信号等功能。基于三维仿生模型在细胞分化、异质性、信息传递、基因表达等方面的优势，使其成为药物筛选、精准医疗等方面不可或缺的一部分[7-9]。

本研究采用的三维培养平台为光子晶体微载体，光子晶体微载体利用单乳液微流控装置生成单分散乳液液滴，再经缓慢干燥固化使得二氧化硅纳米粒子自组装形成光子晶体微载体，并通过高温煅烧提高微载体的机械强度。由于微载体是通过单分散的二氧化硅纳米粒子自组装得到的，其纳米粒子之间会形成贯通的纳米孔道，再将生物相容性水凝胶灌注到载体中进行细胞培养[10-12]。本研究首先检测常规化疗药物DOX、紫杉醇(PTX)、顺铂(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)在三维培养平台和二维培养平面对CD117+CD44+A2780和A2780细胞增殖抑制和促凋亡中的作用，再检测课题组建立的复合载药系统在三维和二维培养环境中对两株细胞的化疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CD117+CD44+A2780和A2780细胞株购自南京凯基生物公司，光子晶体微载体由东南大学生物电子学国家重点实验室赠予。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 干细胞完全培养基培养CD117+CD44+A2780，含有10%胎牛血清的DMEM培养A2780细胞，均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况3～4 d传代1次。

1.2.2 三维细胞培养平台的构建 分别收集CD117+CD44+A2780和A2780细胞，调整细胞密度为2×105个·ml-1。取多个光子晶体微载体铺在96孔板的孔洞中，滴加1 ml的细胞悬液于光子晶体微载体表面，添加对应培养基。37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，经Hoechst33342染色后荧光显微镜观察并将这些光子晶体微载体转移至6孔板中继续培养，24 h后荧光显微镜再次染色观察此微载体。

1.2.3 三维培养平台及二维培养平面的细胞增殖 按照1.2.2的方式构建光子晶体微载体的三维培养平台，细胞分别在6孔板中培养24、36、48、72 h后，将光子晶体微载体从培养基中取出并放置在平皿中，加入PBS后用吸管用力吹打微载体，显微镜下观察当光子晶体微载体表面几乎无细胞附着时取出，离心收集细胞加入培养基制成细胞悬液，使用细胞计数板计数，实验重复3次。同时，在相同时间点胰酶消化收集二维平面培养的细胞，按照同样的方式进行细胞计数。

1.2.4 三维及二维培养环境中细胞的化疗敏感性 按照上述方式构建两株细胞的三维培养平台，待光子晶体微载体转至6孔板后分别加入DOX、PTX、CDDP和5-FU，调整终浓度为20 μg·ml-1。再收集2×105个·ml-1的CD117+CD44+A2780和A2780细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板上，加入相应的培养基继续培养24 h，同样再加入DOX、PTX、CDDP和5-FU，并调整终浓度为20 μg·ml-1。每组细胞在与药物共孵育24 h后通过MTT比色法测定抑制率。

1.2.5 三维及二维培养环境中细胞的化疗凋亡率 按照1.2.2的方式构建光子晶体微载体的三维培养平台和相应的二维培养平面，待细胞培养72 h后加入10 μmol的CDDP、DOX、PTX和5-FU共孵育12 h，各组收集5×105个细胞，加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞和5 μl Annexin V-FITC混匀后再加入5 μl Propidium Iodide，室温下避光反应5～15 min后上机检测各组的细胞凋亡率。

1.2.6 HMSN复合载药系统对三维培养细胞的化疗效果 根据课题组之前的研究，按照同样的方法构建HMSN-COOH@DOXfluorescence NVP复合载药系统，取1 mg分散在10 ml PBS中，在三维和二维培养的CD117+CD44+A2780及A2780细胞中每组分别加入200、400 μl后共孵育12 h，各组收集5×105个细胞，加入500 μl的Binding Buffer和5 μl Annexin V-FITC混匀后再加入5 μl Propidium Iodide，室温下避光反应5～15 min 后上机检测各组的凋亡率。

1.3 分组

再将实验分为HMSN复合载药系统组和游离药物组，在三维和二维培养的CD117+CD44+A2780及A2780细胞中加入400 μl HMSN复合载药系统，游离药物组加入与此等量的游离DOX和NVP，分别与细胞共孵育12 h 后，按照上述方式检测各组的细胞凋亡率。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 光子晶体微载体三维细胞培养平台的构建

将细胞接种于光子晶体微载体24 h后，经荧光显微镜观察可发现大量的细胞已附着在此微载体上，接种48 h后附着的细胞逐渐增多(图1)。

A.CD117+CD44+A2780接种24 h；B.CD117+CD44+A2780接种48 h；C.A2780接种24 h；D.A2780接种48 h图1 光子晶体微载体三维细胞培养平台A.The CD117+CD44+A2780 cell after inoculated 24 h; B.The CD117+CD44+A2780 cell after inoculated 48 h; C.A2780 cell after inoculated 24 h; D.A2780 cell after inoculated 48 hFig 1 3D cultivation of photonic crystal microcarriers

2.2 三维培养平台和二维培养平面的细胞增殖

分别在24、36、48、72 h后收集三维平台及二维培养平面中的CD117+CD44+A2780细胞，统计两组细胞量；在相同时间点收集两种培养平台或平面中的A2780细胞，统计两组细胞量(表1)。CD117+CD44+A2780细胞在三维培养平台的增殖速度要明显快于同时间的二维培养平面(P<0.05)，同样A2780细胞在三维培养平台的生长速度也显著增长(P<0.05)，见图2。

图2 CD117+CD44+A2780和A2780细胞在三维培养平台和二维培养平面的细胞增殖Fig 2 The cell proliferation of CD117+CD44+A2780 and A2780 on conventional and three-dimensional bionic platforms

表1 CD117+CD44+A2780和A2780细胞株在三维培养平台和二维培养平面中的细胞量 ×105个·ml-1Tab 1 The cell count of CD117+CD44+A2780 and A2780 on conventional and three-dimensional bionic platforms ×105 ml-1

2.3 三维和二维培养环境中细胞的化疗敏感性

三维和二维培养环境中20 μg·ml-1的DOX、PTX、CDDP和5-FU对CD117+CD44+A2780细胞的抑制率明显低于对A2780细胞的抑制率(P<0.05)(表2)。三维培养环境中CD117+CD44+A2780细胞比二维环境中的CD117+CD44+A2780细胞表现出对以上化疗药物更强的耐药性(P<0.05)，同时三维培养平台中的A2780比二维培养平面上的A2780的耐药性更强，抑制率更低(P<0.05)(图3)。

图3 三维和二维培养环境中CD117+CD44+A2780和A2780细胞的化疗敏感性(* P<0.05)Fig 3 The chemosensitivity in CD117+CD44+A278 and A2780 cell group on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

表2 化疗药物在二维培养平面和三维培养平台对两组细胞的抑制率 %Tab 2 The inhibition rate of chemotherapy drugs on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

2.4 三维和二维培养环境中细胞凋亡率

根据流式细胞仪检测结果，三维培养环境中CD117+CD44+A2780和A2780细胞的凋亡率均低于二维培养环境中培养的细胞(表3)，三维培养环境中的细胞表现出更强的抗凋亡作用和耐药性(P<0.05)(图4)。

图4 三维和二维培养环境中CD117+CD44+A2780和A2780细胞的凋亡率(* P<0.05)Fig 4 The apoptosis rates in CD117+CD44+A278 and A2780 cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

表3 CD117+CD44+A2780和A2780细胞株在两培养平台(平面)不同药物组中的凋亡率 %Tab 3 The apoptosis rates of chemotherapy drugs in two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

2.5 HMSN复合载药系统对三维培养细胞的化疗效果

HMSN复合载药系统的用量在200、400 μl时，A2780在三维和二维培养环境中的凋亡率之间差异无统计学意义(P>0.05)。200 μl HMSN复合载药系统对二维培养的CD117+CD44+A2780细胞的促凋亡作用要强于三维环境中培养的细胞(P<0.05)；当HMSN复合载药系统的用量提高至400 μl时，两种培养环境中细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。不同浓度的HMSN复合载药系统对三维和二维的培养环境中的细胞均有较好的促凋亡作用，HMSN复合载药系统在三维细胞培养环境中对肿瘤细胞和肿瘤干细胞均展现出较为有效、稳定的促凋亡作用。

表4 HMSN复合载药系统在三维及二维培养环境中对两株细胞的促凋亡作用 %Tab 4 The apoptosis rates of HMSN compound drug delivery system on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

游离药物对三维环境中培养的CD117+CD44+A2780和A2780细胞的促凋亡作用均小于二维培养环境(P<0.05)。在三维培养平台中HMSN复合载药系统组CD117+CD44+A2780和A2780细胞的凋亡率显著高于游离对照组，说明在三维细胞培养环境中HMSN复合载药系统依然能够发挥有效的促凋亡作用，特别是对耐药性和抗凋亡作用较强的CD117+CD44+A2780同时具有高效的杀伤作用，为进一步进行在体实验提供了依据。见表5、图5。

表5 游离药物在三维及二维培养环境中对两株细胞的促凋亡作用 %Tab 5 The apoptosis rates of free drug on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

图5 在三维和二维培养环境中HMSN复合载药系统和游离对照组CD117+CD44+A2780和A2780细胞的化疗敏感性(* P<0.05)Fig 5 The apoptosis rates of CD117+CD44+A278 and A2780 cells in HMSN compound drug delivery system and free drug groups on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

3 讨 论

卵巢癌的高死亡率与化疗耐药密切相关，近些年来针对卵巢癌的靶向治疗一直是探究的热点，其中借助生物材料的靶向药物传输成为重点的研究方向[13]。针对卵巢癌研发的新型药物除了在常规的二维培养平面进行其药效的评估，更重要的是尽量模拟肿瘤细胞的在体状态，将药物应用在三维的细胞培养平台中，更为精确地评估药效，同时能更为精准地预测动物实验效果。

本研究借助光子晶体微载体构建了肿瘤细胞的三维培养平台，光子晶体微载体可为肿瘤细胞提供有效的附着表面，同时光子晶体微载体可悬浮在培养基中，卵巢癌细胞与表面接触不如二维平面培养中那样紧密，为卵巢癌细胞提供了更为立体的仿生的增殖环境[14-15]。通过荧光显微镜观察，我们可以发现卵巢癌细胞在光子晶体微载体表面聚集，会形成丘状细胞团，此三维培养平台既实现了肿瘤细胞的贴壁培养又实现了悬浮培养。

在体的肿瘤细胞常常表现出更为顽强的耐药性，进一步降低了临床化疗的效果，本研究将具有肿瘤干细胞特性的A2780和耐药性强的CD117+CD44+A2780细胞接种培养在光子晶体微载体的三维培养平台中[16]，与传统的二维培养平面相比，在此三维培养平台中细胞对常规的化疗药物敏感性均显著降低，进一步证实本研究的光子晶体微载体培养平台具有良好的仿生效果，可以作为药物初步筛选的平台。我们课题组基于实体肿瘤的组织增强渗透和保留效应(enhanced permeability and retention effect,EPR)和卵巢癌肿瘤高表达IGF-1R设计了HMSN复合载药系统，按照同样的方式检测此复合载药系统在三维环境中的化疗效果。HMSN复合载药系统对三维培养环境中的CD117+CD44+A2780和A2780细胞均展现出较强的促凋亡作用，当HMSN复合载药系统的剂量达到400 μl 时，其对三维培养和二维培养环境中的两株细胞的促凋亡作用无明显差异，同时其促凋亡作用显著强于等量的游离对照组，HMSN复合载药系统在三维培养平台中对于肿瘤细胞和耐药性强的肿瘤细胞均可发挥良好的促凋亡作用。

光子晶体微载体作为新型的生物仿生材料，为肿瘤细胞的三维培养模型的构建提供了基础，为化疗药物的初步筛选提供了理想的仿生环境。HMSN复合载药系统在三维环境中对肿瘤细胞，特别是耐药性细胞仍然能够发挥有效的抗肿瘤作用，为其在动物实验和在体实验效果的预期提供了有力的依据。