刘丹，周晓榕，熊兰，刘国晨，张洪新

(空军军医大学第二附属医院 疼痛科，陕西 西安 710038)

内质网与线粒体均是细胞内参与多个重要生物学过程调控的细胞器[1-2]。其中，内质网在细胞蛋白合成与转运、脂代谢等过程中发挥调控作用，而线粒体则参与细胞能量代谢、凋亡与氧化还原稳态等的调控[3]。大量研究[4-5]表明，内质网和线粒体功能异常与人类多种疾病的发生发展密切相关。近年来，随着超高分辨显微领域的发展，内质网与线粒体间的密切联系被逐步揭示[6]。研究[7-8]发现，线粒体膜与内质网膜可通过一系列蛋白质的相互作用形成物理上的紧密连接，进而发挥一系列对细胞功能的调控作用。内质网和线粒体相互作用紊乱与多种疾病的发生发展密切相关，如帕金森病[9]与糖尿病[10]等。近年来，内质网和线粒体相互作用紊乱也被证实与肿瘤的发生发展密切相关[11]。

囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAPB)是定位于内质网膜上与囊泡发生关系密切的重要蛋白[12]。研究发现，VAPB可通过与线粒体膜上的蛋白酪氨酸激酶相互作用蛋白51(PTPIP51)蛋白结合[13]，参与内质网与线粒体间紧密连接结构的组成[14]。以往在乳腺癌中研究[15]发现，VAPB表达在乳腺肿瘤组织中显著上调，且VAPB表达上调促进了乳腺癌细胞的增殖。但目前，VAPB在包括肝癌在内其它恶性肿瘤中的表达与生物学作用均尚不十分清楚。

本研究将分别通过生物信息学方法与免疫组化、RT-PCR、蛋白质印迹实验，分析肝癌组织与细胞系中VAPB的表达改变，并采用MTS、EdU和流式细胞术分析VAPB在肝癌细胞活力、增殖与凋亡中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 肝癌癌组织与癌旁正常肝组织样本

共收集137例于2016至2018年间在唐都医院普外科进行肝癌手术患者的癌组织与癌旁组织，术中切除肿瘤组织后立即将样本置于液氮中保存，所有患者均在术前签署了知情同意书并在术后经病理确诊为肝癌。

1.2 肝癌细胞与正常肝细胞系

人肝癌细胞(HLE、Hep3B、HCC-LM3和SMMC-7721)与人正常肝细胞HL7702(LO2)均购自中国科学院上海细胞库，所有细胞均培养于DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养液，培养液内加入了10%体积的小牛血清，培养箱内温度为37 ℃，CO2体积分数为5%。

1.3 实验方法

1.3.1 生物信息学分析 利用在线阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户网站UALCAN[16]对VAPB在肝癌患者肿瘤组织中的表达及其在患者预后评估中的价值进行分析，基因表达数据来源于肿瘤基因组图谱TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库。

1.3.2 免疫组化染色 首先，将在液氮中保存的肝癌组织与癌旁组织取出，随后置于福尔马林中固定24 h，石蜡包埋后进行切片。切片依次经历65 ℃烤片、二甲苯透明、梯度酒精脱水后，对切片中损伤的抗原进行柠檬酸高压修复。用3%双氧水去除内源性过氧化物酶后加入VAPB抗体(武汉三鹰，14477-1-AP)并于4 ℃反应12 h，PBS洗3次后依次加入免疫组化试剂盒(福州迈新，KIT-5010)中的二抗与三抗，PBS洗3次后用DAB显色并用苏木素对细胞核进行衬染，最后于显微镜下对染色结果进行观察拍照。

1.3.3 siRNA转染 分别将靶向VAPB的小干扰siRNA片段与无关对照siRNA片段转染肝癌细胞，其中siVAPB序列为5′-UGUUACAGCCUUUCGAUUA-3′。对照siCtrl序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。siRNA转染严格按lipofectamine3000(赛默飞公司)说明书进行，siRNA转染24 h后即可进行RNA与蛋白提取，以及其它细胞活力、增殖与凋亡实验。

1.3.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验 首先，用Trizol裂解液裂解细胞并用RNA提取试剂盒(OMEGA，R6688)提取各组细胞内的总RNA，随后将所提RNA进行反转录合成cDNA，以反转录所得cDNA为模板对目的基因表达进行RT-PCR检测。VAPB扩增引物序列为F-5′-AGATGGACTGCGGATGAGGAA-3′，R-5′-CAGTTGGGGCTAATGCTGAAA-3′。将β-actin作为内参分子，对各组细胞所得结果进行均一化处理，β-actin扩增引物序列为F-5′-TCGCCTTTGCCGATCCG-3′，R-5′-ATGATCTGGGTCATCTTCTCG-3′。各组细胞中VAPB分子的相对表达量计算采用2-ΔΔCt公式进行。

1.3.5 蛋白质印迹实验 弃去各组细胞培养上清，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min，将细胞裂解液转移至EP管内并在4 ℃离心收集上清，向上清蛋白中加入5×loading buffer并在开水中煮5 min。将相同量的蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶泳道内进行电泳分离，随后将分离后的蛋白转印至PVDF膜，并将膜于5%脱脂牛奶中封闭1 h，滴加VAPB抗体(武汉三鹰，14477-1-AP)并在4 ℃孵育12 h，PBS清洗后加入二抗并在室温下孵育1.5 h，PBS清洗后加入发光液对各组细胞中目的蛋白表达对应的条带进行显影。

1.3.6 MTS检测细胞活力 将不同处理组的肝癌细胞以1×103个·孔-1的密度接种至96孔板内，分别在细胞培养第0、1、2、3、4天，向各组细胞孔内加入25 μl的MTS反应液并在37 ℃条件下反应1 h，于490 nm波长处用酶标仪检测各组细胞的吸光值。最后，以时间(d)为横轴，吸光值(OD)为纵轴绘制细胞活力曲线。

1.3.7 EdU检测细胞增殖 将不同处理组的肝癌细胞用蛋白酶消化、离心与计数，随后将细胞接种至6孔板内，待贴壁后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗去多聚甲醛后加入0.2 ml的EdU染液染色20 min，PBS清洗后用细胞核DNA荧光染料DAPI衬染细胞核，PBS清洗完毕后在荧光显微镜下对最终EdU与DAPI染色结果进行观察与拍照。

1.3.8 流式细胞术检测细胞凋亡 将不同处理组的肝癌细胞用蛋白酶消化、离心与计数，加入70%的冰乙醇固定2 h，离心弃去固定液后加入PBS重悬细胞，加入Annexin V-FITC反应液后于室温孵育15 min，随后加入PI反应液避光孵育10 min，最后用流式细胞仪对各组细胞凋亡比例进行分析。

1.4 统计学处理

统计分析用SPSS 17.0软件，3次独立重复实验结果用均数±标准误表示，组间差异显著性检验采用t检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 VAPB在肝癌组织中的表达显著上调

首先，我们用生物信息学在线分析工具UALCAN，对TCGA公共数据库中肝癌组织与正常肝组织中VAPB的表达进行了分析，结果显示：与正常肝组织相比，VAPB在肝癌组织中的表达显著上调(图 1A)，且VAPB表达还呈现出随着肿瘤恶性程度的加重而逐步升高的趋势(图1B)。同时，预后分析发现，VAPB高表达患者较VAPB低表达患者具有更差的预后(图1C)。

A.正常肝组织与肝癌组织中VAPB表达差异分析；B.不同恶性分级肝癌组织中VAPB表达分析；C.VAPB表达与肝癌患者预后分析图1 基于UALCAN的VAPB表达分析A.VAPB expression in normal tissues and tumor tissues of liver; B.VAPB expression in different stages of liver cancer; C.Prognostic analysis of VAPB expression for patients with liver cancerFig 1 UALCAN-based bioinformatics analysis of VAPB expression

为验证TCGA公共数据分析所得结果，我们进一步用免疫组化法对137例肝癌患者癌与癌旁组织中VAPB的表达进行了检测，结果如图2所示，VAPB在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。

图2 免疫组化分析肝癌组织与癌旁组织中VAPB的表达(Scale Bar=20 μm)Fig 2 Immunohistochemistry analysis of VAPB expression in tumor and non-tumor tissues of liver cancer (Scale Bar=20 μm)

2.2 肝癌细胞中VAPB表达显著高于正常肝细胞

为验证肝癌组织中得到的结果，我们又分别用RT-PCR与蛋白质印迹实验对4种肝癌细胞(HLE、Hep3B、HCC-LM3和SMMC-7721)与1株正常肝细胞(HL7702)中VAPB的表达进行了检测，结果如图3所示：与正常肝细胞HL7702相比，VAPB在所有4种肝癌细胞中的表达均显著升高，这与VAPB在肝癌组织中表达上调的结果相一致。

图3 RT-PCR (A)与蛋白质印迹(B) 实验检测肝癌与正常肝细胞中VAPB的表达Fig 3 Detection of VAPB expression by RT-PCR and Western blotting analysis in normal liver cells and liver cancer cells

2.3 下调VAPB降低了肝癌细胞的活力与增殖

为分析VAPB在肝癌生长中的调控作用，我们用向VAPB表达较高的HCC-LM3细胞转染siRNA干涉片段的方法，构建了VAPB低表达肝癌细胞模型。转染siRNA干涉片段24 h后，用RT-PCR与蛋白质印迹法检测VAPB表达干涉效率，结果如图4所示，与转染对照siRNA干涉片段相比，转染靶向VAPB的siRNA干涉片段后，肝癌HCC-LM3细胞中VAPB的表达在mRNA(图4A)与蛋白水平(图4B)均显著降低，表明该细胞模型可满足后续对于VAPB在调控体外肝癌细胞生长中作用研究的需要。

图4 RT-PCR(A)与蛋白质印迹法(B)检测siRNA对肝癌HCC-LM3细胞中VAPB表达的干扰效率Fig 4 RT-PCR(A)与Western blotting (B) analysis for VAPB expression upon siRNA transfection in HCC-LM3 cells

用MTS实验分析下调VAPB对肝癌HCC-LM3细胞活力的影响，结果如图5所示：与转染对照siRNA片段(siCtrl)相比，转染靶向VAPB干扰片段(siVAPB)的HCC-LM3细胞活力显著降低，尤其在细胞生长至第4天时最为明显。

图5 MTS实验分析下调VAPB后HCC-LM3细胞活力的改变Fig 5 MTS assay for the changes of cell viability upon VAPB down-regulated expression in HCC-LM3 cells

为进一步分析VAPB在肝癌细胞生长中的调控作用，我们又采用EdU细胞增殖实验分析了下调VAPB后肝癌HCC-LM3细胞增殖能力的改变，结果如图6所示：siRNA下调VAPB表达后，处于增殖期的肝癌细胞比率显著降低，表明下调VAPB抑制了肝癌HCC-LM3细胞的增殖。

图6 EdU实验分析下调VAPB后HCC-LM3细胞增殖的改变Fig 6 EdU assay for the changes of cell proliferation upon VAPB down-regulated expression in HCC-LM3 cells

2.4 下调VAPB诱导肝癌细胞凋亡增多

考虑到肿瘤生长由细胞增殖与凋亡共同决定，因而我们又利用流式细胞仪分析了下调VAPB后肝癌HCC-LM3细胞凋亡的改变，结果发现下调VAPB表达后，肝癌HCC-LM3细胞的凋亡比例显著上升(图7)。

图7 流式细胞术分析下调VAPB后HCC-LM3细胞凋亡比率的改变Fig 7 Flow cytometry for the changes of cell apoptosis upon VAPB down-regulated expression in HCC-LM3 cells

3 讨 论

线粒体与内质网相关膜结构MAM是内质网膜与线粒体膜紧密连接的特化部分，是近年来随着超高分辨显微技术发展被逐步认识的功能性膜结构[8]。研究[16]表明，MAM在调控内质网与线粒体功能，如细胞内Ca2+稳态、氧化应激、脂质代谢、细胞凋亡、蛋白质合成与转运等过程中发挥了重要作用。MAM结构和功能异常也被证实与多种疾病发生发展密切相关，包括神经退行性疾病、糖尿病与肿瘤等[9,10-11]。VAPB是内质网膜上参与MAM结构形成的重要蛋白[12]。以往研究[15]发现，VAPB在乳腺癌中表达显著上调并促进了乳腺癌细胞的增殖。但目前，VAPB在肝癌中表达与生物学作用均尚不清楚。本研究中，我们对TCGA公共数据库的生物信息学分析与免疫组化实验结果均证实，VAPB在肝癌组织中的表达显著高于正常肝组织。同样，VAPB在肝癌细胞系中的表达也显著高于正常肝细胞系。此外，我们的公共数据分析还发现，VAPB表达上调与肝癌患者不良预后显著相关，提示VAPB是潜在的肝癌预后标志物。由于我国肝癌患者中绝大多数为乙型肝炎病毒(HBV)阳性(本研究137例肝癌病例中HBV阳性患者115例，占比83.9%)，因此VAPB表达上调是否与HBV感染相关值得未来研究去深入探讨。

VAPB在肝癌组织与细胞中表达异常升高提示其可能在肝癌发生发展中起促进作用。进而，我们在用siRNA下调VAPB表达后检测了肝癌细胞的活力、增殖与凋亡。结果发现VAPB表达下调显著抑制了肝癌细胞的活力与增殖，同时诱导肝癌细胞凋亡的发生。这与以往在乳腺癌中的研究结果相一致，该研究发现，上调乳腺内皮细胞中VAPB表达可促进细胞的增殖，而下调VAPB表达则可抑制乳腺癌细胞的增殖，将下调VAPB表达的乳腺癌细胞接种至裸鼠皮下后，细胞在体内的生长也被显著抑制[8]。肿瘤在体内的生长取决于细胞增殖与凋亡速率，我们的研究结果发现下调VAPB抑制了肝癌细胞活力与增殖，并诱导了肝癌细胞的凋亡，表明VAPB可通过促进肝癌细胞增殖并抑制凋亡而促进肿瘤的生长。目前，对于VAPB表达上调如何促进肿瘤细胞增殖的机制仍不十分清楚，对乳腺癌研究发现AKT磷酸化激活介导了VAPB对细胞增殖的调控[15]，但VAPB是如何通过影响内质网与线粒体间的相互作用进而激活AKT信号，目前尚不明确。此外，导致乳腺癌与肝癌组织细胞中VAPB表达上调的分子机制也尚不清楚。以上两个问题均有待未来研究进一步阐明。

本研究发现，VAPB在肝癌组织细胞中表达异常上调并促进了肝癌的生长，提示VAPB是潜在的肝癌预后判断与药物治疗靶标。