宋旭东，罗波，陈华轩，张逵，王潇娅

(南充市中心医院 神经外科，四川 南充 637000)

脑胶质瘤是颅内常见的源自神经胶质细胞的原发性颅脑肿瘤，该病不同病理级别患者的临床治疗方案存在较大差别，且预后差异也较大[1]。胶质瘤具有恶性程度高、术后易复发等特点，虽然对脑胶质瘤的术前评估及治疗手段不断完善，但术后高复发率及高相关并发症仍是临床难以解决且急需解决的问题[2]。脑胶质瘤的标准治疗以手术切除为主，并结合放化疗等综合治疗手段[3]。血浆基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)被认为对溶栓后出血有预测作用[4-5]，MMP-2为最主要的降解细胞外基质之一，与脑胶质瘤之间的关系最为密切，其表达水平与胶质瘤细胞增殖和侵袭性均存在密切相关性[6]。临床研究[7]表明，降低MMP-2的表达水平可抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭。微小RNA(microRNA，miR)是一类由18～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA,通过与靶基因的mR结合，抑制其翻译或促进降解,从而起到调控靶基因表达的作用[8]。miR在肿瘤发生发展中的作用已有广泛研究，且有研究[9]表明可通过部分miR对MMP-2进行调控。miR-105在胶质瘤中高表达[10]，miR-105可通过靶向紧密连接蛋白ZO-1破坏血管内皮屏障，促进肿瘤转移[11]。

本研究通过选取2018年7月至2021年7月间于我院行手术治疗的脑胶质瘤患者，探讨脑胶质瘤术后miR-105、MMP-2的表达与脑胶质瘤术后复发的关系，为临床评估患者的预后及调整合适的治疗方式提供理论依据，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2018年7月至2021年7月间于我院行手术治疗的脑胶质瘤患者89例，收集脑胶质瘤组织与瘤旁组织。患者原发病灶术后按照WHOCNS2016病理分级：Ⅰ级6例，Ⅱ级30例，Ⅲ级34例，Ⅳ级19例；其中男47例，女42例；年龄28～73岁，平均(45.95±12.44)岁。术后对患者随访9个月，每月随访1次，观察是否复发。脑胶质瘤复发诊断：连续两次MRI检查显示病灶明显增大。纳入标准：(1) 初次手术；(2) 术后病理检查证实为脑胶质瘤；(3) 年龄≥18岁；(4) 术前无放疗、化疗；(5) 既往体检及精神状况正常；(6) 病例资料齐全，临床随访资料完整。排除标准：(1) 患其他原发性肿瘤及癫痫等；(2) 患脑血管疾病(如脑缺血、脑出血、脑梗死等)；(3) 严重感染；(4) 心、肺、肝、肾功能不全等；(5) 患病毒性肝炎、自身免疫性疾病；(6) 既往有颅脑损伤史；(7) 交流障碍及既往有精神病史；(8) 未按时随访。本研究经我院伦理委员会审核批准，患者或其家属均自愿且签署知情同意书。

1.2 细胞株、试剂和仪器

脑胶质瘤细胞株 U251(上海极威生物科技有限公司)；miR提取试剂盒、荧光定量及逆转录试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)；TRIzol(RNA 提取试剂盒) 试剂(大连宝生物工程有限公司)；MMP-2试剂盒(福州迈新公司)；miR-105、MMP-2 DNA 序列，miR-105、MMP-2荧光定量相关引物(上海生工生物工程公司)；RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清、DMEM 培养液(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；山羊抗兔一抗、二抗(碧云天生物技术研究所)；RIPA裂解液、PMSF(国药集团化学试剂有限公司)；细胞计数板(上海五相仪器仪表有限公司)；转膜仪(江苏金域国胜实验仪器厂)；流式细胞仪(美国BD biosciences公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 RT-PCR检测组织miR-105表达水平

用TRIzol法提取组织总RNA，用Nanodrop分光光度计测定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按试剂盒说明书合成样品cDNA和进行荧光定量 PCR的扩增，反应条件为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环;72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法计算miR-105相对表达量。

1.3.2 免疫组化法检测组织中MMP-2表达水平

取新鲜肿瘤组织，以10%中性甲醛固定24 h后切块。按照MMP-2试剂盒说明书采用免疫组化SP法进行检测，切片机对石蜡标本进行4 μm厚切片，将所取肿瘤标本先进行二甲苯脱蜡，酒精脱水处理，脱水处理完毕后标本在pH值为6.0的酸性缓冲液中进行抗原修复处理，使用枸橼酸冲洗液连续冲洗3次后加10%的过氧化酶阻断内源性过氧化酶的活性，室温孵育后再次缓冲液冲洗3次，加血清再次室温孵育后处理干净血清，滴加一抗，37 ℃孵育1 h, PBS洗涤3 min 3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min, PBS洗涤3 min 3次，DAB翻译显色后自来水下冲洗，苏木素复染，常规固定后观片。免疫组化阅片：选择肿瘤组织内阳性染色密集区，细胞核/质呈棕黄色颗粒，400倍镜下计数500个细胞，计算阳性百分率。未发现阳性细胞为-；≤10%的阳性细胞为+；>10%～≤50%的细胞阳性为++；>50%的细胞阳性为+++。+及以上为阳性表达。

1.3.3 细胞实验

1.3.3.1 细胞培养与转染 脑胶质瘤细胞U251的培养在 5% CO2、37 ℃的培养箱中进行；将冻存的细胞用镊子从液氮中取出,放入水浴锅,快速摇动至完全消融,解冻后以3 000 r·min-1低速离心5 min,吹打细胞成细胞悬液,以1×109L-1接种于培养瓶中，细胞培养液为含100 ml·L-1胎牛血清的DMEM培养液，添加10%胎牛血清和1%青链霉素，置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。细胞转染参照LipofectamineTM2000试剂说明书上的步骤进行：首先制备LipofectAMINETM2000复合物和DNA复合物(每孔含4 μg浓度为1 μg·μl-1的质粒和246 μl的无血清培养基)，随后将二者混匀，温室静置20 min。将混合物加入6孔板，温室培养6 h后更换含血清培养基，继续培养48 h。将处理后U251细胞分为对照组(NC组)、miR-105组、MMP-2组和miR-105联合MMP-2组,对照组不作任何处理,实验组中依次加入miR-105、MMP-2和miR-105联合MMP-2作用于细胞48 h。

1.3.3.2 RT-PCR 用TRIzol法促进细胞裂解，添加氯仿0.2 ml，4 ℃条件下12 000 r·min-1离心15 min，取无色水相上层，添加等体积异丙醇并沉淀。加入适量乙醇(75%)清洗，获得RNA沉淀，提取总RNA，用Nanodrop分光光度计测定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按试剂盒说明书合成样品cDNA和进行荧光定量 PCR的扩增，反应条件为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环;72 ℃延伸10 min。存储在4 ℃条件下。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。将脑胶质瘤细胞 U251中的总 RNA 与miR提取后，再以总 RNA 为模板，将其反转录为cDNA，miR则应用逆转录试剂盒。用2-ΔΔCt法计算miR-105、MMP-2表达量。miR-105上游引物5′-TCAAATGCTCAGACTC-3′，MMP-2 上游引物 5′-AGAAGGCTGTGTT-CTTCGCA-3′,GAPDH上游引物5′-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3′。

1.3.3.3 蛋白质印迹实验 细胞转染48 h后,用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。以12 000 r·min-1离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取。蛋白质印迹实验时，首先将待检测蛋白样品按30 μg·孔-1上样后行SDS-PAGE电泳，然后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱牛奶粉液封闭2.0 h后，加入相应的DIRAS3抗体(1∶1 000)或者β-actin抗体(1∶1 000)，在4 ℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗。次日取出膜，在室温孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min·次-1，洗去残余的一抗；分别加HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h。TBST(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min次-1，洗去残余的二抗后最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

1.3.3.4 CCK-8法检测U251细胞的增殖实验 采用CCK-8试剂盒,将处理过的U251细胞以5×103个·孔-1接种在96孔板中, 37 ℃下孵育24、48、72、96 h。加入 CCK-8试剂,再次孵育1 h。采用分光光度计在490 nm波长测量吸光度,平均OD值用于估计每个组的细胞数量。

1.3.3.5 Transwell法检测U251细胞侵袭和划痕实验检测细胞迁移 将8 μm的Transwell分别放于24孔板中,将处理过的各组U251细胞置于培养基中,用胰酶进行消化,按照每孔2.0×105个·ml-1的密度加入Transwell小室内,每孔加入200 μl的细胞悬液和RPMI 1640培养基,置于CO2培养箱中培养,弃去培养基,取出小室,10%的甲醇固定,采用结晶紫染色15 min,PBS洗去浮色,晒干,显微镜(×100)下观察,随机取3个视野拍照,计算细胞数量。划痕实验：制备U251细胞悬液并进行细胞计数，然后将数量相同的U251细胞种植到5 cm板中，经培养过夜后每个孔中均铺满了均匀单层细胞，然后使用大小相同的枪头进行划痕，每个孔的划痕粗细均匀，划下的细胞采用 PBS 进行清洗，应用没有血清的培养液培养，在 37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，分别于 1、12、24 h在倒置显微镜下拍照。

1.3.3.6 流式细胞术检测U251细胞凋亡 胰酶消化,分别收集各组的U251细胞,当细胞的密度为1.0×105个·ml-1时接种于6孔板中,然后3 000 r·min-1离心5 min,离心半径为11 cm,离心完成后弃上清,重悬细胞,加入Annexin V-FITC/PI双染色染料,上流式细胞仪检测。

1.3.3.7 预测脑胶质瘤术后复发的ROC曲线分析 通过ROC曲线，在患者出院后进行为期9个月的跟踪随访，比较患者脑胶质瘤术后复发情况与检测期间患者miR-105、MMP-2表达量之间是否存在相关性。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-105和MMP-2在胶质瘤组织中的表达

RT-PCR检测结果显示，胶质瘤组织miR-105表达量为0.19±0.12，低于瘤旁组织的0.56±0.10，P<0.05。免疫组化法染色显示，胶质瘤组织阳性表达率为73.03%(65/89)，高于瘤旁组织的13.48%(12/89)，P<0.05，见图1。

A.MMP-2在脑胶质瘤组织中的表达；B.MMP-2在瘤旁组织中的表达图1 免疫组化法染色检测MMP-2表达A.The expression of MMP-2 in glioma tissue; B.Expression of MMP-2 in paraneoplastic tissuesFig 1 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-2

2.2 术后复发影响因素的多因素Logistic回归分析

Logistic回归分析结果显示，miR-105和MMP-2对脑胶质瘤术后复发存在显著影响；进一步分析可发现，对脑胶质瘤术后复发的影响从大到小依次是MMP-2、miR-105。详见表1。

表1 脑胶质瘤术后复发的Logistic回归分析Tab 1 Logistic regression analysis of postoperative recurrence of glioma

2.3 miR-105、MMP-2预测脑胶质瘤术后复发的ROC曲线分析

miR-105、MMP-2单一及联合检测对脑胶质瘤复发的预测价值ROC曲线显示，以复发组为阳性样本，以无复发组为阴性样本，绘制各指标预测脑胶质瘤术后复发的ROC曲线，结果显示，miR-105、MMP-2单一及联合检测预测术后复发的曲线下面积(AUC)依次为0.735、0.797、0.894，提示miR-105联合MMP-2可预测脑胶质瘤术后复发，见表2、图2。

表2 miR-105、MMP-2预测脑胶质瘤术后复发的ROC曲线分析Tab 2 ROC curve analysis of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

图2 miR-105和MMP-2预测脑胶质瘤术后复发的ROC曲线Fig 2 ROC curve of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

2.4 蛋白质印迹法检测各组蛋白表达

对比转染后NC组、miR-105组、MMP-2组和miR-105联合MMP-2组各组细胞miR-105和MMP-2的表达情况，结果发现，miR-105联合MMP-2组和miR-105组的U251细胞中MMP-2蛋白的表达显著高于NC组(P<0.05), miR-105组和miR-105联合MMP-2组的U251细胞中miR-105的表达明显高于NC组。本研究显示，miR-105联合MMP-2组中MMP-2 、miR-105表达均较低(P<0.05)。见图3。

图3 蛋白质印迹法检测MMP-2、miR-105水平Fig 3 The detection of MMP-2 and miR-105 levels by Western blot

2.5 miR-105和MMP-2水平对胶质瘤增殖的影响

与NC组相比，miR-105转染后细胞OD值随时间的增加而明显降低，MMP-2组细胞OD值随时间的增加而明显升高，表明miR-105明显抑制U251细胞增殖能力，而MMP-2可对细胞增殖起促进作用(均P<0.05),见图4。

图4 MMP-2和miR-105对脑胶质瘤细胞增殖作用的影响(*P<0.05，**P<0.01)Fig 4 Effects of MMP-2 and miR-105 on proliferation of glioma cells(*P<0.05, **P<0.01)

2.6 miR-105和MMP-2水平对胶质瘤侵袭和迁移的影响

MMP-2组细胞侵袭能力明显高于NC组与miR-105联合MMP-2组(P<0.05)，miR-105组侵袭能力与NC组差异较小，但较MMP-2组与miR-105联合MMP-2组明显降低(P<0.05)。见图5。

图5 MMP-2和miR-105对脑胶质瘤侵袭(A)和迁移(B)的影响(*P<0.05)Fig 5 Effects of MMP-2 and miR-105 on invasion(A) and migration(B) of glioma(*P<0.05)

2.7 MMP-2 和 miR-105的表达对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，各组细胞转染后凋亡率NC组为11.26±1.56，MMP-2组为9.86±1.29，miR-105联合MMP-2组为26.72±1.83，miR-105组为29.67±2.29。与NC组相比，miR-105组细胞凋亡率明显升高，而MMP-2组细胞凋亡率有所降低(P<0.05)，miR-105联合MMP-2组同NC组相比凋亡率较高，但较miR-105组较低(P<0.05)。说明miR-105能诱导脑胶质瘤细胞凋亡， MMP-2对细胞凋亡有所抑制，且miR-105可能通过作用于MMP-2对细胞凋亡进行调控。见图6。

A.NC组；B.MMP-2组；C.miR-105联合MMP-2组；D.miR-105组图6 MMP-2和miR-105流式细胞检测结果A.NC group; B.MMP-2 group; C.miR-105+MMP-2 group;D.miR-105 groupFig 6 Flow cytometry results of MMP-2 and miR-105

3 讨 论

脑胶质瘤是较常见的原发性颅内肿瘤，世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类中将胶质瘤通常分为Ⅰ～Ⅳ级[12]，大部分患者首次治疗后仍会出现肿瘤进展或复发，复发的主要原因在于肿瘤细胞不能完全手术清除，复发部位多在原部位，胶质瘤仍有极高的致残率和病死率[12]。由于肿瘤呈浸润性生长，肿瘤全切除率低，术后复发风险高，预后较差。

MMP-2是MMP家族中重要的一员，主要来源于内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞等，是一种酶活性锌离子依赖性肽链内切酶家族，MMP与肿瘤发生及癌细胞生长、增殖、迁移等有关。相关研究[13-17]结果显示，在多种肿瘤细胞中均存在 MMP-2的表达；正常脑组织细胞中MMP-2的表达可能是因为脑组织遭到损伤所引起，因阴性对照组均为脑外伤后行内减压手术的新鲜脑组织，可能脑组织本身已经出现了水肿，损伤到了血脑屏障，导致毛细血管通透性增加，因此致使非正常生理状态下的神经胶质细胞及血管内皮细胞分泌 MMP-2。MMP-2基因有可能作为判断神经母细胞瘤的侵袭性和预后情况的参考指标,可作为其预测指标和干预靶点，对其诊断及治疗提供重要的指导作用[18]。

目前对miRNA功能的研究主要包括对其进行过表达与抑制这两种方式，通过脂质体将其转染到生物体内，从而使内源性 miRNA的表达明显增强。肿瘤的发生发展主要与miRNA调节出现异常有关，但是一个 miRNA 可对多个靶基因产生调控作用，一个靶基因又可能被多个 miRNA 所调控，使得难以完全弄清 miRNA 的功能。与正常细胞相比，肿瘤细胞的 miRNA 表达水平有着明显的差异性，且与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移过程密切相关，因此在肿瘤的治疗中，miRNA 成为了重要的靶点[19]。现有研究表明，miRNA-105与肝癌、结肠癌和卵巢癌的发生发展有着密切关系[20-21]，如在直肠癌中可通过miR-105-5p/RAB22A轴加重结直肠癌的恶性发展，而在心脏缺血性损伤中却又可通过多重途径程序性抑制细胞凋亡。Guan等[22]发现，与正常脑组织相比，miRNA-105在脑胶质瘤组织中异常低表达。在恶性肿瘤中，有let-7、miR-105、miR-124、miR-154等下调 miRNA，且均已经证实在肿瘤细胞的侵袭转移、增殖凋亡过程中起到了明显的调控作用[23-24]。

本研究通过采用免疫组化法检测MMP-2蛋白的表达水平发现，主要在脑胶质瘤细胞的细胞膜、细胞质中存在MMP-2蛋白的表达，少许脑胶质瘤细胞周围血管内皮细胞中也存在MMP-2的表达。MMP-2高表达者复发率高于低表达者，提示MMP-2高表达是脑胶质瘤患者术后复发的危险因素，其可能原因在于MMP-2在细胞基底膜的降解中起着积极的作用，肿瘤细胞侵袭[25]，降解细胞外基质，影响细胞与细胞和基质之间的信号传递，对细胞的生长分化、迁移、黏附、损伤及修复等方面产生影响。miR-105在复发脑胶质瘤患者中呈低表达，提示miR-105低表达是脑胶质瘤患者术后复发的危险因素。各组脑胶质瘤细胞内 MMP-2蛋白均高表达，miR-105 的 mRNA 表达水平与 MMP-2呈负相关(P<0.05)，MMP-2可能为 miR-105 下游靶基因。通过Transwell侵袭实验与划痕实验检测细胞侵袭迁移显示，miR-105可抑制肿瘤侵袭迁移，并对MMP-2增强的侵袭迁移能力进行抑制。结合以上实验结果，推测其可能原因在于miR-105靶向负调控，抑制表达逆转了抑制miR-105对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用，这与现有研究结果有所呼应[26-27]。后续或可通过miR-105对肿瘤细胞的侵袭迁移机制进行研究，可以提高肿瘤的临床治疗效果，延长肿瘤患者的生存期。

综上所述，miR-105在复发脑胶质瘤患者中呈低表达，MMP-2是在复发脑胶质瘤患者中高度表达。miR-105、MMP-2均参与胶质瘤的侵袭、迁移和凋亡，二者对胶质瘤术后复发的预测有一定价值，可能成为胶质瘤的生物学标志物。