周文彬 吕昂 尹吉林 王瑞敏 张金赫 欧阳习 李林娟 王欣璐

[摘要] 目的 制备京尼平交联的131I标记壳聚糖/明胶-拓扑替康膜，并研究复合膜对SK-OV-3荷瘤裸鼠的治疗效果，为同步放化疗载药膜剂的肿瘤治疗等相关研究提供基础。 方法 制备SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠模型，并手术植入复合膜到荷瘤裸鼠腹腔中，观察各组裸鼠的生存周期、转移瘤及血性腹水重量，考察复合膜对腹腔荷瘤裸鼠的治疗效果。 结果 SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠经手术植入复合膜后观察各组生存天数、腹腔转移瘤及血性腹水量可知，同时应用拓扑替康及131I的131I+TPT组疗效优于单独使用拓扑替康或131I，稍次于顺铂对照组，明显优于空白对照组。 结论 131I标记的壳聚糖/明胶拓扑替康载药膜对SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠有一定疗效，能延长荷瘤裸鼠的生存天数并抑制腹腔转移瘤及血性腹水的形成。

[关键词] 壳聚糖；明胶；放射性碘标记；载药；肿瘤治疗

[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）30-0028-04

[Abstract] Objective To prepare Genipin cross-linked 131I-labeled chitosan/gelatin-topotecan membrane， and to investigate the therapeutic effect of the composite membrane on the SK-OV-3 tumor-bearing nude mice， so as to provide a basis for the related research on tumor treatment of concurrent chemoradiotherapy-loaded drug-coated drugs. Methods SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice model was prepared and surgically implanted into the abdominal cavity of tumor-bearing nude mice. The life cycle， metastatic tumor and blood ascites weight of nude mice in each group were observed. The therapeutic effect of composite membrane on abdominal cavity tumor-bearing nude mice was investigated. Results The survival days， abdominal metastases and blood ascites were observed in SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice after surgical implantation of composite membrane. At the same time， the efficacy of the topotecan and 131I in the 131I+TPT group was better than that of topotecan or 131I alone， which was slightly lower than that of the cisplatin in the control group， but was significantly better than that in the blank control group. Conclusion 131I-labeled chitosan/gelatin topotecan drug-loaded membrane has a certain curative effect on SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice， which can prolong the survival days of tumor-bearing nude mice and inhibit the formation of abdominal metastases and bloody ascites.

[Key words] Chitosan； Gelatin； Radioiodine labelling； Drug load； Tumor treatment

在此前的研究中，我们已经制备了京尼平交联的131I标记壳聚糖/明胶-拓扑替康载药膜（131I-CS/G-TPT膜），该复合膜实现了化疗药物拓扑替康（Topotecan，TPT）的负载和131I的标记，体外实验中证实复合膜的缓慢降解及缓慢释药，并在KM小鼠的体内实验中证实复合膜在小鼠腹腔中生物相容性良好且降解缓慢，具备体内应用以治疗肿瘤的应用潜力。

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，以上皮癌最多见，发病率在各妇科肿瘤中位列第三，次于子宫颈癌及子宫体癌，但死亡率却位居第一，发现时常已转移扩散到子宫、双侧附件、大网膜及盆腔各器官，同时也常引起明显的腹水症状。我国女性卵巢癌的死亡率为4.19/10万，虽然不高，但由于卵巢癌的起病隐匿，进展迅速，已经成为严重威胁妇女健康、应当重点预防的妇科肿瘤之一[1]。

拓扑替康由喜树碱转换而成，是一种水溶性的半合成喜树碱衍生物，通過抑制DNA拓扑异构酶（TOPO）而产生抗瘤作用。拓扑替康是美国FDA批准的卵巢癌及小细胞肺癌二线化疗用药，常应用于对顺铂抵抗而化疗失败的复发性卵巢癌及小细胞肺癌[2]，对顺铂（DDP）治疗失败的晚期卵巢癌患者，其疗效达20.5%～25%[3-4]。已有实验表明，对SK-OV-3细胞株造模裸小鼠腹腔内应用TPT，较静脉内应用TPT效果更佳[5]。同时，拓扑替康还是一种放射增敏剂，已有体外实验及动物实验证实了它的放射增敏作用[6-7]。

放射性粒子植入治疗技术简称粒子植入，是一种将放射源植入肿瘤内部，通过持续性近距离放射性治疗以治疗实体肿瘤，最常见的粒子为125-I粒子，常通过介入应用于不可切除的实体肿瘤如前列腺癌、舌癌、纵隔内恶性肿瘤[8-10]等。但是，粒子一经植入后将长时间停留于植入位置，可能会产生粒子掉落、位移，或引起异物肉芽肿等不良反应。再有，粒子为银及钛金属所制，在CT扫描下会引起伪影，影响原有的CT扫描结果。因此，开发新一代具备生物相容性及体内降解的放射性药物的载体，极其需要。而131I-CS/G-TPT膜将可能在体内肿瘤附近发挥作用的同时，缓慢释放药TPT，实施同步放化疗。

1资料与方法

1.1一般资料

主要试剂：人卵巢腺癌细胞株SK-OV-3，广州杰特伟生物科技有限公司；McCoy5A培养基，广州杰特伟生物科技有限公司；PBS，Sigma公司；小牛血清，美国Gibco公司；胰蛋白酶，Sigma公司；DMSO，上海百灵威化学技术有限公司；壳聚糖（脱乙酰度95%），阿拉丁试剂；明胶（化学纯CP），国药集团化学试剂有限公司；拓扑替康，上海北卡医药技术有限公司；131I-碘化钠溶液，广州原子高科同位素医药有限公司；异氟烷，深圳瑞沃德生物科技公司。

主要仪器：CO2细胞培养箱，美国Thermo Scientific公司；超净工作台，苏州净化设备厂；超低温立式冰箱，日本三洋公司；离心机，德国Eppendorf公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；小动物麻醉仪，美国SurgiVet公司。

实验动物：BALB/c-nu裸小鼠，雌性，4周龄，购自南方医科大学实验动物中心：SCXK（粤）2011-0015。伦理委员会批号：44002100011954。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及建立荷瘤鼠模型 取液氮中保存的人浆液性上皮性卵巢腺癌细胞株SK-OV-3，37℃水浴并轻摇冻存管至融化，取出解冻的悬浮液，缓慢移入含10%FBS的McCoy 5A培养基，于37℃、含5%的CO2细胞培养箱中培养。细胞在培养过程中无支原体或细菌的污染。

将已达对数生长期的SK-OV-3单层贴壁细胞，经0.05%胰蛋白酶消化后，用无血清的培养液清洗1次。1000 r/min离心5 min，去除上液后，PBS重悬，根据显微镜下血球计数板中计数，稀释并配备细胞计数为1107，体积为200 μL的SK-OV-3细胞注射液若干。置于4℃中待用，防止细胞黏连。

取4周龄BALB/c-nu裸小鼠（雌性），将含有SK-OV-3细胞注射液200 μL的1 mL注射器贴腹壁向小鼠头部方向缓慢推进针头少许后，再以45°方向刺入腹腔，回抽确认没有刺入血管或肠道后，缓慢推出细胞注射液。腹腔注射细胞计数为1107的细胞注射液200 μL，称重，单笼饲养。裸鼠于无特殊病原菌（Specific pathogen free，SPF）级屏障环境中饲养，温度（24±1）℃，相对湿度为（55±5）%，灯光循环周期为12 h，所用饲料、垫料及饮用水均经高压灭菌处理，所有饲养及操作程序均按照广州军区广州总医院动物实验中心操作规程进行。

1.2.2 荷瘤鼠的分组及治疗 取已接种SK-OV-3细胞14 d的裸小鼠，禁食24 h，诱导麻醉后小鼠呈仰卧位，四肢张开，暴露腹部，并佩戴小型动物用面罩，维持麻醉。麻醉剂为液体异氟烷，倒入麻醉泵挥发罐中，空气气流吹气挥发，诱导浓度为2%，维持浓度为2%。

无菌操作下碘伏擦拭，消毒表皮，沿腹中线作2～3 cm切口后，根据分组，对小鼠作相应处理后，用非吸收线作逐层单纯缝合。分组处理：空白组不作处理；顺铂组关腹后第1、2、3周分别腹腔注射稀盐酸溶解0.2 mg/mL的顺铂溶液0.1 mL；TPT组放入1 cm2京尼平交联的TPT-CS/G膜1块；131I组放入1 cm2京尼平交联的131I-CS/G膜1块；131I-TPT组放入1 cm2京尼平交联的131I-CS/G-TPT膜1块。关腹后碘伏消毒表皮，每只鼠应用链霉素溶液2万单位，并根据分组作相应标记。所用手术器具均经过高压灭菌处理。撤出麻醉面罩，约2 min后裸鼠恢复清醒，术后送SPF屏障环境，单笼饲养。

1.2.3 荷瘤鼠的观察及生存终结 生存期间观察内容：每3天测量体重1次，观察并记录动物生长情况（体重增长或减少）、一般情况（行动迟缓、反应迟钝等疾病状态）、贫血（耳廓苍白）、腹水（腹部膨隆程度、颜色）、恶病质等发生时间及生存期，密切观察裸鼠生长状态。记录裸鼠存活天数，记录时间为裸鼠接种SK-OV-3细胞起至裸鼠生存期终结。

裸鼠自然死亡或濒死（行动迟缓、反应迟钝、体温下降、腹部明显膨隆及变紫青色）后，记录小鼠存活时间，迅速处死小鼠并解剖裸鼠腹部，记录胸腹腔内各脏器肿瘤转移情况、腹水量，留取肿瘤、转移淋巴结及受侵犯脏器组织。

1.3观察指标

①各组荷瘤裸鼠的生存天数；②各组荷瘤裸鼠死亡后的转移瘤重量及血性腹水重量。

1.4 统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行数据分析。计量资料采用独立样本非参数t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 生存周期观察

不同分组荷瘤裸鼠的生存天数见表1，空白组、顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT組的平均生存天数为（46.80±6.05）d、（84.40±12.40）d、（68.80±4.12）d、（65.00±4.34）d、（78.60±3.83）d（n=5），其中空白组为空白对照组，顺铂组为阳性对照组，TPT组、131I组、131I+TPT组为实验组。与空白组对比，顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT组的P值均<0.01，结果均具有显著性统计学差异，提示各组治疗措施均对荷瘤裸鼠有一定效用。

2.2 转移瘤及血性腹水

裸小鼠腹腔接种人卵巢腺癌细胞株SK-OV-3后，最终将产生明显腹腔转移瘤及腹水。荷瘤裸鼠生存期结束后均进行解剖，抽取腹腔内不凝血性腹水，剥离腹腔内转移瘤，并分别称重记录。不同分组荷瘤裸鼠的转移瘤重量见表2，血性腹水重量见表3。空白组、顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT组的转移瘤平均重量分别为（3.0±0.55）g、（1.51±0.22）g、（2.01±0.07）g、（2.05±0.10）g、（1.53±0.12）g（n=4），血性腹水平均重量分别为（4.41±0.22）g、（1.91±0.33）g、（3.48±0.30）g、（3.61±0.31）g、（2.05±0.46）g（n=4）。与空白组对比，顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT组的转移瘤重量组间P值分别<0.01、<0.05、<0.05和<0.01，血性腹水重量组间P值分别<0.01、<0.01、<0.05和<0.01，结果均具有统计学差异，表明本实验各治疗手段对抑制荷瘤裸鼠的转移瘤及血性腹水的形成均具有一定作用。

3讨论

3.1 生存周期观察

与空白组对比，顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT组的P值均<0.01，结果均具有显著性统计学差异，提示各组治疗措施均对荷瘤裸鼠有一定效用。实验组的裸鼠生存天数整体长于空白对照组，即SK-OV-3荷瘤裸鼠经植入TPT-CS/G膜、131I-CS/G膜及131I-CS/G-TPT膜后，生存天数整体较未作处理的SK-OV-3荷瘤裸鼠更高（P均<0.01），结果具有显著性统计学差异，提示各实验组的治疗手段对荷瘤裸鼠均有治疗作用；131I+TPT组裸鼠的生存天数优于TPT组及131I组，组间P值均<0.01，结果具有显著性统计学差异，提示131I-CS/G-TPT膜对荷瘤裸鼠的治疗效果优于单纯结合TPT或131I的CS/G膜；131I+TPT组裸鼠的生存天数稍次于顺铂组（P>0.05），结果无统计学差异，提示131I+TPT组的治疗效果不如但接近于顺铂组；TPT组裸鼠的生存天数略高于131I组（P>0.05），无统计学差异，提示两组治疗效果相接近。

顺铂作为卵巢癌治疗的临床一线用药，其治疗效果是备受肯定的。而拓扑替康已被美国FDA批准为卵巢癌及小细胞肺癌的二线用药，常用于顺铂等化疗药物耐药的患者[11]。本实验的结果表明，131I+TPT的治疗方案对SK-OV-3细胞株治疗有效，但稍不如顺铂组的疗效。这可能是因为本次实验制备131I-CS/G-TPT膜中化疗药物及放疗药物剂量不足。CS/G膜的131I放射性活度本身不高，并随着时间的推移进一步衰减，而且，每1 cm2 CS/G膜中TPT平均每周释放量较少，约为3.73 μg。有学者的体外实验表明，TPT对SK-OV-3有明显的抑制作用，并呈明显剂量依赖，其治疗效果与顺铂相当甚至更强[12]。以131I标记的抗体对卵巢癌细胞杀伤作用的体外实验中也表明，其杀伤力呈一定的剂量依赖性[13]。与131I偶联的单克隆抗体对SK-OV-3荷瘤裸鼠治疗效果的探索实验中，对肿瘤生长的抑制作用也表现出剂量依赖性[14]。

3.2 转移瘤及血性腹水

与空白组对比，顺铂组、TPT组、131I组、131I+TPT组的转移瘤重量组间P值分别<0.01、<0.05、<0.05和<0.01，血性腹水重量组间P值分别<0.01、<0.01、<0.05和<0.01，结果均具有统计学差异，表明本实验各治疗手段对抑制荷瘤裸鼠的转移瘤及血性腹水的形成均具有一定作用；131I+TPT组的转移瘤重量与TPT组、131I组对比，P均<0.01，血性腹水重量与TPT组、131I组对比，P均<0.01，结果均具有显著性统计学差异，提示131I-CS/G-TPT膜对抑制荷瘤裸鼠转移瘤及血性腹水形成的作用，均优于单纯结合131I或TPT的CS/G膜。

131I+TPT组的转移瘤重量及血性腹水重量与顺铂组对比，差异无统计学意义（P均>0.05），表明131I+TPT组对荷瘤裸鼠转移瘤及血性腹水的抑制作用可能稍不如顺铂组，但差异并不明显，表明131I+TPT组与顺铂组治疗效果相近；TPT组的转移瘤重量及血性腹水重量与131I组对比，P均>0.05，结果无统计学差异，提示两组的治疗效用可能比较接近。

转移瘤及血性腹水的结果与表1中荷瘤裸鼠生存天数的结果趋势有一定相似性，即顺铂组对荷瘤裸鼠的治疗效果最佳，131I+TPT组稍次之但差异不大，TPT组及131I组更次之。大量研究已经证实了顺铂经腹腔給药对转移瘤及癌性腹水的抑制作用[15-16]，这也侧面佐证了131I+TPT组对荷瘤裸鼠转移瘤及血性腹水的抑制作用。

131I标记壳聚糖/明胶-拓扑替康载药膜应用于SK-OV-3荷瘤裸鼠腹腔中，对比空白组，载药膜对荷瘤裸鼠具备一定的治疗效果，能延长荷瘤裸鼠的生存期，抑制裸鼠腹腔内转移瘤及血性腹水的形成；其治疗效果优于单独使用拓扑替康或131I，疗效稍逊于顺铂。若提高复合膜拓扑替康和（或）131I的载药量，单位面积的载药膜治疗效果可能接近或优于顺铂。

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（收稿日期：2018-07-11）