张纪妍，曾赛田，奚杰

(沧州市中心医院 妇科，河北 沧州 061000)

卵巢癌(OC)是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，尽管临床在改进治疗方式方面付出了巨大努力，但因OC发病隐匿，且恶性程度高、易于转移和复发，多数患者预后不良[1-2]。因此，早期检测仍然被视为成功治疗和优化OC患者生存率的重要标准。然而常用肿瘤生物标志物缺乏敏感性或特异性，不足以作为预后指标。微小RNA(miRNA)是一类短非编码RNA[3]，可调节癌症相关基因的表达，从而表现出潜在的临床相关性，并用于靶向治疗[4]。内质网应激(ERS)后未折叠蛋白反应(UPR)的激活和相关蛋白表达变化可促进肿瘤细胞的生长、存活和侵袭，最终影响肿瘤特征及预后[5]。而OC作为一种恶性实体瘤，一直受到ERS的挑战。最近，有研究提出miR-30c-2-3p可能通过降低内质网的折叠能力导致ERS增强，从而促进OVCAR3和SKOV3细胞凋亡[6]。因此，本研究旨在分析OC患者血清miR-30c-2-3p与ERS相关蛋白的关系，评估其对OC患者预后的预测效能，为临床提供可靠的预后生物标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究为一项前瞻性单中心研究，经伦理委员会批准后，向所有患者解释了本研究的目的。2018年1月至2020年12月，本研究共招募了70例于我院接受手术治疗的OC患者(OC组)，术前3 d采集血清样本。收集新鲜的OC组织并立即在液氮中速冻，并在RNA分离前储存在-80 ℃环境下。所有组织均由2名病理学专家根据苏木精-伊红和免疫组织化学染色确诊。纳入标准：(1) 经术后病理检查确诊为OC；(2) 年龄≥18岁；(3) 初诊，在手术前未接受过任何抗肿瘤治疗。排除标准：(1) 合并其他部位原发恶性肿瘤者；(2) 合并严重心、肝、肾等重要脏器障碍，自身免疫性疾病，全身性感染性疾病者；(3) 样本或临床数据不足、失访者。根据2014年妇产科联合会(FIGO)分类进行肿瘤分期。所有患者均有完整的临床病理资料，并签署了知情同意书。此外，招募了100例既往无良性疾病或恶性肿瘤病史的女性健康个体作为对照组。抽取每个参与者静脉血，3 000 r·min-1离心10 min，然后收集上清液并储存在-80 ℃直到使用。两组年龄、体重指数具有可比性(P>0.05)。

1.2 肿瘤裂解物的制备和抗C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78，又称为BIP)蛋白质印迹法分析

将OC组织样品在含有蛋白酶及磷酸酯酶抑制剂混合物(美国Sigma)的RIPA缓冲液(200～400 μl)中裂解，进行短超声处理以形成均质组织裂解物。用BCA测定法(美国Thermo Fisher)定量蛋白浓度。使用10%十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质(30～40 μg蛋白)，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用CHOP抗体(1∶20 000，英国Abcam)或BIP抗体(1∶15 000，英国Abcam)结合膜蛋白，使用辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗兔IgG抗体(1∶1 000，中国北京TransGen Biotech)二次孵育。使用ECL试剂观察蛋白表达情况。

1.3 定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-30c-2-3p表达

术前3 d及术后3 d早上8点采集患者肘静脉血5 ml，对照组早上8点采集肘静脉血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸二钾的抗凝管中，850 r·min-1离心15 min。吸取上层血清(2 ml)转移至离心管，并以16 000 g离心10 min，沉淀细胞碎片。将上清液保存在新离心管中并储存在-80 ℃环境下。严格按照mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(美国Ambion)的说明书进行总RNA提取。使用逆转录试剂盒(美国Ambion)将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板用miRNA RT-qPCR试剂盒(美国Ambion)进行PCR扩增。PCR条件如下：90 ℃ 5 min，1个循环；90 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，共40个循环。所有样品重复检测3次。使用2-ΔΔCt法计算miR-30c-2-3p相对表达量，其中Δ周期阈值(Ct)=CtmiR-30c-2-3p-Ct内参U6。

1.4 随访观察

所有患者以电话或复诊方式随访，随访统计患者3年期间生存情况。随访包括全身及盆腔检查、盆腹腔超声检查，术后2年内2～3个月随访1次，之后每3～6个月进行1次随访。本研究主要观察终点为无病生存期(DFS)，定义为患者手术后组织学诊断确诊的日期到复发、死亡或最后1次随访的日期。所有患者均完成随访，无失访病例。

1.5 生物信息学分析

为了解CHOP、BIP在OC中的表达，我们使用了从基因表达谱交互分析(GEPIA)(http:∥gepia.cancer-pku.cn/)数据库获得的RNA序列数据分析OC标本和正常卵巢组织标本中CHOP、BIP转录本数据差异。使用Kaplan-Meier绘图仪网站(http:∥kmplot.com/analysis/)评估这两种因子的预后价值，该数据库可用于评估54 000种基因对21种癌症类型生存率的影响，最大的数据集包括2 190例OC病例。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，血清miR-30c-2-3p表达符合正态分布，通过t检验检测2组的差异。采用卡方检验或Fisher精确概率分析方法分析血清miR-30c-2-3p表达水平与临床和病理参数之间的相关性。使用XLSTAT软件构建受试者工作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)。生存分析采用Kaplan-Meier图和Log Rankχ2检验，并进行COX回归模型分析。相关分析采用Pearson相关系数法。以P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组受试者血清miR-30c-2-3p表达比较

经qRT-PCR分析，OC组患者基线血清miR-30c-2-3p表达水平显著低于对照组受试者(0.77±0.25vs.1.15±0.39，t=7.869，P<0.001)。经ROC曲线分析，基线血清miR-30c-2-3p表达诊断OC的AUC为0.785(95%CI0.718～0.852)，cut-off值为0.703，见图1。

图1 血清miR-30c-2-3p表达诊断OC的ROC曲线Fig 1 ROC curve of serum miR-30c-2-3p expression in diagnosis of OC

2.2 基线血清miR-30c-2-3p表达与OC患者临床病理特征的关系

根据OC患者基线血清miR-30c-2-3p表达均值(0.77)，将基线血清miR-30c-2-3p表达≤0.77的OC患者纳入低表达组(n=34)，>0.77的患者纳入高表达组(n=36)。经分析低表达组中FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期的患者例数更多，且肿瘤直径更大(P<0.05)，见表1。

2.3 基线血清miR-30c-2-3p与组织ERS相关蛋白表达的相关性

经Pearson相关系数分析，基线血清miR-30c-2-3p表达水平与OC组织CHOP表达水平呈正相关(r=0.483，P<0.001)，与BIP表达水平呈显著负相关(r=-0.240，P=0.045，图2)。进一步校正年龄、组织学类型、分化程度和血清肿瘤标志物后，经多元线性回归分析，OC组织中CHOP(t=4.080，非标准化系数=0.884，标准化系数=0.448，95%CI0.451～0.967，P<0.001)、BIP(t=-2.048，非标准化系数=-0.477，标准化系数=-0.245，95%CI为-0.943～-0.012，P=0.045)都是影响基线血清miR-30c-2-3p表达水平的独立因子。

2.4 基线血清miR-30c-2-3p表达与OC患者术后复发的相关性

绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行Log-rank检验，基线血清miR-30c-2-3p低表达OC患者中位DFS显著短于高表达者(34个月vs. 43个月，χ2=7.515，P=0.006，图3)。进一步经单因素和多因素COX回归分析，结果显示基线血清miR-30c-2-3p低表达为OC患者术后复发的独立临床因素(OR=0.399，95%CI0.201～0.791，P=0.009)。

2.5 基于数据库分析CHOP和BIP在OC组织中的表达及其与预后的关系

我们使用GEPIA数据库中426个OC和88个正常卵巢组织的基因表达数据进行分析，OC组织中CHOP mRNA表达显著低于正常卵巢组织，而BIP mRNA表达则高于正常卵巢组织(P<0.05)。根据癌症基因组图谱(TCGA)数据绘制Kaplan-Meier生存曲线，CHOP低表达队列的中位生存期为20个月，而CHOP低表达队列的中位生存期为16个月，CHOP高表达组的总生存率(OS)较低表达组高(P<0.05)。见图4。

图4 在数据库中CHOP 和BIP mRNA的表达和预后Fig 4 Expressions and prognosis of CHOP and BIP mRNA in the database

3 讨 论

目前，OC患者的预后仍然很差，这可能是因为缺乏用于早期诊断、预后评估和精准治疗的有价值的生物标志物。因此，了解与OC发生和发展相关的作用机制对于挑选新的分子标志物用于早期诊断和评估预后至关重要[7]。本研究分析发现基线血清miR-30c-2-3p表达水平在OC患者中普遍降低，而且在区分OC组与对照组方面表现良好，这说明miR-30c-2-3p可能参与OC的发生、发展。

miRNA是一类长度为21～23个碱基的非编码单链小分子RNA，在转录后调节生物体内源基因表达，参与调控机体正常发育和疾病发生发展等过程[8]。血液中循环的miRNA被认为可作为各种疾病的生物标志物，并在细胞-细胞通信中发挥重要作用。这些miRNA不仅在受体细胞中具有活性功能，而且许多miRNA可以与细胞表面的受体相互作用[9]。目前已有多种miRNA被发现与OC预后相关，如miR-1231表达上调可抑制细胞增殖和细胞周期进程，miR-1231表达较低预示着OC患者预后较差[10]；OC患者miR-196b的高表达也与较差的预后相关，miR-196b可以通过调节与细胞活力和有丝分裂有关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B表达促进OC细胞增殖[11]；miR-182也在OC组织中上调，对OC的生物学进展至关重要[12]。

有研究[13]发现，miR-30家族对OC患者也具有预后价值，其较高表达显著改善了OC患者的OS及无进展生存率。Zhang等[14]证实，与正常卵巢上皮细胞相比，所有OC细胞系中均为低miR-30表达，同时过表达miR-30的卵巢SKOV3和A2780癌细胞系均表现出较低的增殖率，表明miR-30家族在卵巢癌中具有一定的抑癌基因活性。miR-30a/c-5p也可直接抑制DNA甲基转移酶1(DNMT1)以及Snail。强制表达miR-30a/c-5p或敲除DNMT1和Snail可促进CP70细胞的顺铂敏感性并部分逆转上皮间质转化(EMT)。同时，抑制miR-30a/c-5p或DNMT1和Snail的异位表达在顺铂敏感的OC细胞系A2780细胞中诱导顺铂耐药和部分EMT[15-16]。此外，与正常卵巢细胞组织相比，miR-30c在OC中低表达与转移相关基因 1(MTA1)表达上调有关，这可能是OC细胞转移的机制之一[17]。而在卵巢SKOV3和OVCAR3癌细胞系中，浓度为1 nmol·L-1～20 μmol·L-1的溶血磷脂酸刺激30～60 min增强细胞增殖，会代偿性增加miR-30c-2-3p表达。这表明生长因子诱导的OC细胞增殖通过显著增加miR-30c-2-3p介导中和反应，从而降低SKOV3和OVCAR3细胞中B-细胞淋巴瘤因子9的表达和细胞增殖，可能是一种调节下游信号转导的机制[18]。本研究在OC患者基线血清中发现miR-30c-2-3p低表达，此外基线血清miR-30c-2-3p低表达与FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤直径更大相关。

基线血清miR-30c-2-3p低表达还与术后高复发率相关，Rezghi等[6]认为miR-30c-2-3p在OC中的作用机制与ERS相关，ERS凋亡相关的CHOP和BIM适度上调，而BIP下调。ERS后，由于错误折叠/未折叠蛋白质的积累，细胞应激会激活UPR，从而停止蛋白质的翻译并刺激未折叠和聚集蛋白质的降解。最终，除非蛋白质稳态恢复，否则细胞会发生凋亡。UPR信号通路在癌症中具有潜在的临床相关性，因为它们影响肿瘤特征，是临床结果的预后因素。上皮性OC中ERS相关蛋白的表达增加表明了上皮性OC中ERS和UPR的作用[19]。本研究中术前血清miR-30c-2-3p与组织ERS相关蛋白CHOP及BIP的相关性说明miR-30c-2-3p可放大ERS的严重性，促进细胞凋亡，即miR-30c-2-3p对ERS诱导的OC细胞凋亡具有调节作用。此外，我们使用GEPIA数据库基因表达数据进行分析发现，CHOP高表达组OC患者的OS较低表达组高。

综上所述，根据我们的初步研究结果，OC患者基线血清miR-30c-2-3p表达多呈差异性降低，而这可能是OC恶性转化和进展的一个重要特征。此外，血清miR-30c-2-3p低表达可能与肿瘤细胞中CHOP表达降低和BIP表达上调有关，这也预示着OC患者生存预后不良。尽管这种可能性必须在涉及大量患者的研究中得到证实，但miR-30c-2-3p很可能成为与OC相关的潜在生物标志物。