闫凤霞， 杨 玲， 温贤将， 郭 睿， 郭旭凯， 段 冰， 邵 强， 柳青山

（山西农业大学高粱研究所，山西晋中 030600）

高粱作为一种新型健康杂粮，越来越受到养生人士的青睐（杨玲等，2021）。高粱籽粒营养特别丰富，其中蛋白质、微量元素、膳食纤维等含量均高于其他谷物，蛋白质所含氨基酸种类较齐全，能为人类和动物生长发育提供所需的基本营养（冯红红，2021）。高粱籽粒中含有许多次生代谢产物和内源性物质，如固醇、酚类物质、多烷醇等，其中一些功能性成分能够减少慢性疾病的危害，如机体高血糖、心脑血管等代谢病，对慢病具有很好预防作用。高粱中的单宁原花青素是一类酚类化合物，是类黄酮的一个亚类，该物质具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗关节炎活性，并在预防心脏病、皮肤老化和各种癌症中发挥重要作用（蒋依然，2020；Dykes Linda，2019；闫慧诗等，2018）。目前，高粱已成为功能食品及生物医学领域的研究热点（谢甜等，2021；陈华敏，2018；Shen等，2018；王坚强等，2017；Gowd等，2017）。

肠道微生物参与动物机体的营养代谢和免疫应答，对宿主生长发育具有重要影响（孙铁虎等，2021；徐晓锋等，2019；Kim等，2018）。动物肠道微生物组因其数量庞大，组成和结构复杂等特点，成为近几年人们重点关注的内容。研究表明，肠道微生物群落结构受遗传、饮食和地理环境等因素影响，其中饮食是影响肠道微生物的主要因素（任彩君等，2021；任世恩等，2020；索效军等，2019；卢烽等，2018）。高粱饲喂畜禽的研究大都集中在生产性能等方面，而对肠道菌群的影响却鲜见报道。随着DNA测序技术与生物信息学的迅速发展，对肠道微生物的菌群多样性、菌群功能、群落结构等方面的研究已经越来越离不开高通量测序技术。高通量测序已经应用于很多领域，其克服了传统培养鉴定的工作量大、耗时长的缺点，可以快速、准确的检测大批量样本，从基因水平准确鉴定微生物的分类及种群关系，是研究肠道菌群的重要手段（黄志强等，2021）。该研究旨在通过16SrDNA高通量测序的方法，研究不同饲粮条件下蛋鸡肠道细菌多样性及菌群结构差异，初步探索高粱对蛋鸡肠道微生物的影响效果。

1 材料与方法

1.1 试验设计 试验采用单因子完全随机区组设计，将120只健康、体重均匀、日龄150 d的海兰褐蛋鸡随机分为两组，分别饲喂玉米日粮和高粱日粮，玉米组饲粮为60%玉米，40%蛋鸡浓缩料；高粱组饲粮为60%高粱，40%蛋鸡浓缩料。试验期5个月。供试鸡群按常规饲养方法管理，每天饲喂3次，自由采食饮水。

1.2 指标测定 试验期内观察每组鸡只健康状况，记录每组产蛋量、耗料量和蛋重指标。试验中期随机抽取每组10只鸡采血取样，检测血液中胆固醇等指标。甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 粪便总DNA提取和高通量测序 每组随机选取6只蛋鸡，在试验末期分别采集鸡只新鲜粪样20 g，装10 mL灭菌冻存离心管中，利用Mobio PowerFecelFecel DNA kit提取粪便DNA。以提取的DNA为模板，利用细菌16S全长27F_（16SF）5'-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'和1492R_（16S-R）5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'进行PCR扩增，将检测合格的细菌DNA送至百迈客生物科技有限公司，并采用PacBio测序平台进行高通量测序。

1.4 数据处理与统计分析 利用Smrtlink输出CCS文件，使用lima v1.7.0软件，通过barcode识别CCS，获得Raw-CCS序列；采用Cutadapt 1.9.1软件识别并去除引物，得到Clean-CCS序列；利用Uchime v4.2鉴定得到Effective-CCS。使用Usearch软件以相似度≥97.0%为标准，将Effective-CCS聚类成操作分类单元OTU（Operational Taxonomic Unit），采用Qilme2计算Alpha多样性指数。采用SPSS软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同饲粮对蛋鸡生产性能的影响 高粱组的蛋鸡产蛋率和平均蛋重均极显著（P<0.01）的高于玉米组，其中产蛋率较玉米组增加10.39%，平均蛋重较玉米组平均增加5.20%，表明部分高粱品种加入蛋鸡饲粮中，可显著提高蛋鸡的产蛋率和平均蛋重，是优良的可选择用于代替玉米的蛋鸡能量饲料（表1）。

表1 各处理蛋鸡生产性能指标

2.2 不同饲粮对蛋鸡血液指标的影响 蛋鸡饲喂高粱后，其体内血清总胆固醇含量较玉米组降低20.22%，血清总甘油三脂含量降低53.18%，血清低密度脂蛋白含量降低17.92%，血清高密度脂蛋白含量降低44.36%，其中血清总甘油三脂和血清高密度脂蛋白含量两组差异达到显著水平（P<0.05），表明饲喂高粱可明显降低蛋鸡体内血清甘油三酯的含量，对蛋鸡机体的脂代谢有一定调节作用（表2）。

表2 各处理血清指标mmol/L

2.3 不同饲粮蛋鸡肠道菌群结构总体差异 本研究共获得属于细菌的序列68378条，平均5698条CCS序列；依据97%的序列相似性鉴定出392个OTUs聚类信息，其中玉米饲粮组315个，高粱饲粮组320个，两组共有的OTUs数为243个，玉米组特异的OUTs为72个，高粱组特有的OUTs为77个（图1）。玉米饲粮组的序列数高于高粱组，但平均OTU数少于高粱组，高粱组OTU数量极显著高于玉米组（P<0.01）。

图1 各处理特征Venn图

2.4 不同饲粮蛋鸡肠道菌群多样性分析 本试验中12份样本文库的覆盖率 （Coverage）为99.42%～95.11%，表明本次测序结果可以代表鸡粪样本中微生物的真实情况，UPGMA分析将12份样本可聚为玉米饲粮组和高粱饲粮组2类，表明两组样品间群落组成的差别较大，表明饲喂高粱对蛋鸡肠道菌群的影响较明显（图2）。Alpha多样性分析中（图3），高粱日粮组的ACE、Chao1、Simpson、Shannon指数均高于玉米饲粮组，其中Chao1、Simpson、Shannon分 别 高 出 玉 米 饲 粮 组77.27%、74.74%和51.27%，且差异水平均达到极显著（P＜0.01），表明饲粮中添加高粱可以提高蛋鸡肠道菌群多样性。

图2 UPGMA分析聚类图

图3 Alpha多样性指数

2.5 不同饲粮蛋鸡肠道菌群构成分析 各处理细菌门水平上，丰度前十的物种分别为厚壁菌门（Firmicutes），拟杆菌门（Bacteroidetes），变形菌门（Proteobacteria），疣微菌门（Verrucomicrobiota），软壁菌门（Tenericutes），螺旋菌门（Spirochaetota），Kiritimatiellaeota，埃普西隆杆菌门（Epsilonbacteraeota），梭杆菌门（Fusobacteriota），互养菌门（Synergistota）。玉米组蛋鸡肠道第一优势菌为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度值为81.44%，第二优势菌为拟杆菌门 （Bacteroidetes），相对丰度值为9.64%，第三优势菌为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度值为7.62%；高粱组蛋鸡肠道第一优势菌为拟杆菌门 （Bacteroidetes），相对丰度值为44.26%，第二优势菌为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度值为36.67%，第三优势菌为疣微菌门（Verrucomicrobia），相对丰度值为6.32%。其中高粱组的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度值较玉米组降低44.77%，差异水平极显著；高粱组的拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）较玉米组分别增加34.62%、6.20%，高粱组的软 壁 菌 门（Tenericutes）、螺 旋 菌 门（Spirochaetes）和互养菌门（Synergistetes）的相对丰度值较玉米组都有明显增多。

图4 样品门水平物种分布

在细菌属水平上丰度前十的细菌属分别是 乳杆菌属（Lactobacillus），罗姆布茨菌（Romboutsia），拟杆菌属（Bacteroides），理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group），拟杆菌属不可培养菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales），鸡肝菌属（Gallibacterium），艾克曼菌属（Akkermansia），考拉杆菌属（Phascolarctobacterium），普雷沃式菌属（Prevotellaceae_UCG-001），扭链瘤胃球菌属（[Ruminococcus]-torques-group）。玉米组第一优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus），相对丰度值为38.30%，第二优势菌属为罗姆布茨菌（Romboutsia），相对丰度值为29.92%，第三优势菌属为鸡肝菌属（Gallibacterium），相对丰度值为6.91%。高粱组第一优势菌属为拟杆菌属（Bacteroides），相对丰度值为16.39%，第二优势菌属为拟杆菌属不可培养菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales），相对丰度值为9.97%，第三优势菌属为理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group），相对丰度值为9.74%。其中高粱组乳杆菌属（Lactobacillus）、罗姆布茨菌（Romboutsia）的相对丰度较玉米组分别降低28.64%、25.31%。高粱组拟杆菌属（Bacteroides）、拟杆菌属不可培养菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales）、理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 艾 克 曼 菌 属（Akkermansia）和考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）的相对丰度较玉米组分别增加15.32%、9.15%、6.07%、5.85%、4.89%。

图5 样品属水平物种分布

3 讨论

日粮中添加高粱可一定程度影响蛋鸡生产性能，目前，该方面研究主要针对肉鸡的研究较多，鲜见蛋鸡方面的报道。Fagundes等（2017）研究表明，利用高粱全部或部分代替玉米饲喂肉鸡，对肉鸡的采食量、体重和饲料转化率没有显著影响。 然而，Silva等（2015）研究结果证明，饲喂高粱可显著提高肉鸡以上指标，类似的，本研究中高粱组的蛋鸡产蛋率和平均蛋重均极显著（P<0.01）的高于饲喂玉米组。可见，高粱的饲喂效果可能受诸多因素影响，其机制需要进一步研究。另外，本研究中高粱饲粮组的血清胆固醇和总甘油三脂含量含量均低于玉米饲粮组，这可能与高粱种皮中所含单宁物质有关，Zheng等（2018）和Masumoto等（2016）研究表明，高粱单宁能够调节脂质代谢相关基因表达水平，减轻高脂引起的肥胖，改善血脂水平等。

动物肠道菌群种类的多样性和丰富性对维持肠道微生态平衡起着至关重要的作用（Yu等，2015），肠道微生物群落受诸多因素影响，其中饮食是影响肠道微生物菌落多样性的主要因素之一。本研究分别用60%的玉米和高粱添加蛋鸡浓缩料饲喂蛋鸡，基于PacBio测序平台对不同饲喂组蛋鸡粪便菌类16SrDNA进行高通量测序，每处理重复6次，UPGMA聚类将12份样本精确地区分为玉米饲粮和高粱饲粮组，表明每个处理内采样重复性较好，可有效减小组内误差，提高试验结果的可靠性。16SrDNA测序共获得属于细菌的序列68378条，鉴定出392个OTUs聚类信息，两组共有的OTUs数为243个，其中饲喂高粱组平均OTU数量极显著高于玉米组（P<0.01），多样性指数分析结果表明高粱日粮组的Chao1、Simpson、Shannon指数都极显著高于玉米饲粮组（P<0.01），以上结果均表明饲喂高粱增加了蛋鸡肠道微生物多样性。

肠道菌群构成分析表明在门水平玉米饲粮组和高粱饲粱组蛋鸡肠道两大优势菌均是Firmicutes和Bacteroidetes，这与Erinle等（2022）的研究结果一致，另外，相关研究发现肠道菌群中高Firmicutes/Bacteroidetes（F：B）值与动物肥胖症、肠道菌群失调等疾病有重要关联（Magne等，2020；Razavi等，2019），动物饲喂中添加抗生素可显著提高F：B值（Dudek-Wicher等，2018）。本研究中，饲喂高粱显著增加了Bacteroidetes菌群丰度，降低了Firmicutes菌群丰度，从而减小了Firmicutes/Bacteroidetes（F：B）值，这可能与高粱籽粒中的多酚类物质有关，体外试验表明植物多酚类物质可显著降低F：B值（Xue等，2016）。在属水平上高粱显著增加了Bacteroides，uncultured_bacterium_of_Bacteroidales，Akkermansia，Phascolarctobacterium的丰度，其中Akkermansia菌属可改善动物肥胖、炎症反应以及调节机体的免疫应答，维持体内代谢平衡等作用。

4 结果

本试验结果表明，高粱型日粮可提高蛋鸡的产蛋率和平均蛋重，降低蛋鸡体内总胆固醇及低密度胆固醇含量，增加蛋鸡肠道细菌多样性，对蛋鸡肠道菌群具有一定的正向调控作用。参与调节的物质可能与高粱种皮的一些功能成分有关，该结论还有待于进一步深入研究。