罗安，胡佳

江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一种食管动力障碍性疾病[1]，以烧心和反流为主要临床表现，其不典型症状包括胸痛、上腹部烧灼感、咽中梗阻感等，临床上常常容易被误诊漏诊。一项Meta分析指出，我国部分社区人群胃食管反流病的患病率为7.69%[2]，但由于现代社会生活节奏和饮食结构的变化，中国GERD的发生率正逐渐增高。当前，西医治疗GERD主要以质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)或钾离子竞争性酸阻滞剂(potassium-competitive acid blocker，P-CAB)为主，同时还有促胃动力药、H2受体拮抗剂以及外科手术治疗等[3-5]，但是长期服用PPI有很多不良反应[6-7]。中医药在提高GERD疗效、减少不良反应以及降低患者的经济负担上有明显优势[8-10]。

GERD在古代并无中医病名，根据其症状可归属“吐酸”“食管瘅”“嘈杂”等范畴[11]，半夏泻心汤是《伤寒论》中的经典名方，由半夏、大枣、甘草、干姜、黄芩、黄连、人参等7味中药组成。方中半夏既能降逆和胃，又能散结消痞，故为君药；黄芩、黄连苦寒降胃，干姜温中散寒，三者合为臣药；人参、大枣既能防黄芩、黄连苦寒伤阳，又能制约半夏、干姜之辛热，共为佐药；甘草补中健脾，调和诸药为使药，全方配伍寒热并用，辛苦并进，补泻兼施，是治疗寒热错杂型胃食管反流病的代表方[12]。现代药理学研究表明，半夏泻心汤在临床上治疗消化系统疾病十分广泛，疗效显著，能够保护胃黏膜[13]，在治疗GERD时发挥抗炎、促食管动力等作用[14-17]。本研究基于中药及复方多成分、多靶点、多通路的作用特点，采用网络药理学和分子对接探究半夏泻心汤治疗胃食管反流病的分子作用机制，为后续的临床实践提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 半夏泻心汤组方中药活性成分及相关靶点的获取基于中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)分别以半夏泻心汤组方中药半夏、大枣、甘草、干姜、黄芩、黄连、人参为检索词进行检索，获得其化学成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为标准筛选获得半夏泻心汤组方中药活性成分及其对应的CID号，并通过PubChem数据库利用CID号检索出相对应活性成分的Canonical SMILES码。将活性成分的Canonical SMILES码输入Swiss Target Prediction数据库(https：//www.swisstargetprediction.ch/)，设置物种为“Homo sapiens”，筛选出每个活性成分的相关作用靶点及其对应的标准基因名称，将所有标准基因名称汇总，删除重复项，即得到半夏泻心汤组方中药活性成分相关靶点。

1.2 GERD相关靶点的获取在DisGeNET数据库(https：//www.disgenet.org/search)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)中以“gastroesophageal reflux disease”为关键词进行检索，汇总得到的疾病基因名称，删除重复项后获得疾病相关靶点。

1.3 半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点的获取将半夏泻心汤组方中药活性成分相关靶点与GERD疾病靶点导入韦恩图绘制平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行映射，取交集并将交集结果导出，即为半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点。

1.4 “半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络的构建将半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点与所有中药活性成分相关靶点的基因名称进行匹对，将匹对结果汇编成txt文件导入Cytoscape 3.9.0软件构建“半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络并进行拓扑分析，筛选半夏泻心汤治疗GERD的核心活性成分。

1.5 构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络及筛选关键靶点将半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点导入STRING数据库(https：//www.string-db.org/)，将物种设置为“Homo sapiens”，得到PPI网络，下载txt文件，处理后导入Cytoscape3.9.0软件，通过软件中的CytoNCA插件对网络进行拓扑分析，根据度中心性(degree centrality，DC)将分析结果前10%的关键节点导出，再将其重新导入STRING数据库得到关键靶点的PPI网络，拓扑分析筛选出半夏泻心汤治疗GERD的核心靶点。

1.6 关键靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析将关键靶点导入DAVID数据库(http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL，列表类型选择Gene List，进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。设定P值<0.01，并根据P值进行排序，通过微生信绘图平台(www.bioinformatics.com.cn/)对GO功能富集分析的前20条结果和KEGG信号通路富集分析的前10条结果进行绘图。

1.7 分子对接验证将“半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络中度值排名靠前且OB值、DL值远高于标准值的活性成分与关键靶点PPI网络中度值排名靠前的靶点进行对接，通过pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载活性成分2D结构，通过PDB数据库(https：//www.rcsb.org)获取靶点蛋白3D结构，利用Chem 3D对活性成分进行优化，并在PyMOL软件中删除蛋白受体的水分子，运用Autodock Vina和Pymol将活性成分受体和靶点蛋白配体进行对接及优化制图。

2 结果

2.1 半夏泻心汤组方中药活性成分及相关靶点基于TCMSP分别以半夏泻心汤方中半夏、大枣、甘草、干姜、黄芩、黄连、人参为检索词进行检索，以OB≥30%且DL≥0.18为标准进行筛选，删除无对应CID号和Canonical SMILES码的成分，获得半夏泻心汤组方中药活性成分，其中半夏11个、大枣17个、甘草64个、干姜3个、黄连13个、黄芩29个、人参17个，删除重复成分后得到活性成分140个，部分活性成分见表1。将140个活性成分的Canonical SMILES码输入Swiss Target Prediction数据库，删除重复项后得到1 111个药物靶点。

2.2 GERD疾病相关靶点在DisGeNET数据库、OMIM数据库和GeneCards数据库中以“gastroesophageal reflux disease”为关键词进行检索，删除重复项后获得4 176个疾病相关靶点。

2.3 半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点将1 111个半夏泻心汤组方中药活性成分相关靶点与4 176个GERD疾病靶点导入韦恩图绘制平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行映射，得到412个交集靶点，即为半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点，见图1。

表1 半夏泻心汤组方中药部分活性成分相关信息

图1 半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点韦恩图

2.4 “半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络的构建将半夏泻心汤治疗GERD的潜在作用靶点与所有中药活性成分相关靶点进行匹对，将成分与靶点映射汇编成txt文件，将文件导入Cytoscape3.9.0软件构建“半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络发现，该网络共涉及553个节点和 5 115 条边，网络拓扑分析计算化合物的度值(degree)，列出度值排名前10位的化合物，结合表1可以看出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黄芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、表小檗碱(epiberberine)是几味中药的共有成分，且OB值及DL值远高于筛选标准值，推测，槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、山柰酚、豆甾醇、表小檗碱等是半夏泻心汤治疗GERD的核心活性成分。见图2、表2。

图2 “半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络图

表2 “半夏泻心汤-活性成分-靶点”网络度值排名前10位的化合物信息表

2.5 PPI网络及关键靶点将筛选得到的412个潜在靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，将分析后的数据导入Cytoscape3.9.0软件，通过软件中的CytoNCA插件进行拓扑分析，根据度中心性将分析结果前10%的关键节点导出，得到42个关键靶点，再将其重新导入STRING数据库得到关键靶点的PPI网络，通过度值赋予靶点颜色，度值越大则靶点颜色越深，由此推测靠近圆中心的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、热休克蛋白90AA1(heat shock proteins 90AA1，HSP90AA1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、缺氧诱导因子1亚基α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等为半夏泻心汤治疗GERD的核心靶点。见图3。

图3 关键靶点PPI网络图

2.6 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析GO功能富集分析包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)3个方面，将42个靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析共得到515个BP条目、63个CC条目及93个MF条目，其中BP主要与基因表达的正/负向调控(positive/negative regulation of gene expression)、细胞因子介导的信号通路(cytokine-mediated signaling pathway)等过程相关；CC主要涉及大分子复合物(macromolecular complexe)、细胞质(cytoplasm)、胞质溶胶(cytosol)等；MF主要涉及酶结合(enzyme binding)、蛋白质结合(protein binding)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)等功能。设置P<0.01，根据P值排序后，选取排名前20的条目绘制条形图，见图4。对42个关键靶点进行KEGG信号通路富集分析筛选得到150条信号通路，主要涉及肿瘤相关通路(pathways in cancer)、肿瘤中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等通路，推测半夏泻心汤可能通过以上通路发挥治疗胃食管反流病的作用。设置P<0.01，根据P值排序后选取排名前10位的条目绘制气泡图，见图5。

图4 关键靶点GO功能富集分析

图5 关键靶点KEGG信号通路富集分析

2.7 分子对接验证一般认为，结合能越小，受体与配体之间的活性越强，稳定性越高。将筛选得到的核心活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素同时与关键靶点HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53进行“多对一”分子对接，结果显示，核心成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素与关键靶点HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53结合能均小于-7 kcal·mol-1，结合稳定。见表3，图6。

表3 半夏泻心汤核心成分与关键靶点结合能 (kcal·mol-1)

注：红色代表槲皮素；青色代表β-谷甾醇；紫色代表豆甾醇；黄色虚线代表氢键

3 讨论

GERD是由胃酸、胃蛋白酶、胆汁等反流至食管并损伤食管黏膜产生的炎症反应，其发病机制十分复杂，炎症因子是其中一个重要的因素。GERD患者食管活检样本检测发现，IL-6和IL-8等炎性因子参与胃食管反流病的发生[18]。阿布拉江·米吉提等[19]指出不仅是白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8等炎症因子和部分趋化因子，自由基同样也参与了GERD患者食管黏膜的损伤，且自由基水平越高，损伤程度越严重。

β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是半夏泻心汤组方中药中几种中药的共同成分，且OB值、DL值较筛选标准值高，度值大，故认为这三者为半夏泻心汤治疗GERD的核心活性成分。β-谷甾醇具有多种药理作用，其作用之一就是抗炎。β-谷甾醇可明显减少胸膜渗出量及中性粒细胞[20]。Liao等[21]研究发现，β-谷甾醇可通过降低细胞中TNF-α、IL-6和IL-8的水平抑制巨噬细胞中NF-κB信号通路的激活，从而减少炎症的发生和细胞损伤。豆甾醇是一种植物甾醇，可显著抑制LPS诱导的 COX-2 升高，COX-2高表达能加重食管组织损伤[22]。李建军[23]发现98例GERD患者食管组织标本中 COX-2 的表达水平增高，尤其以巴雷特食管表达最高，且随着血清中炎性因子的表达水平增高而增高。研究表明，反流性食管炎患者的食管黏膜 COX-2 表达水平明显高于正常食管黏膜[24]，证实高表达COX-2能够加重食管黏膜损伤，导致GERD发生。槲皮素作为一种黄酮类化合物，具有抗感染等作用[25-28]。周霄楠等[29]通过构建LSP诱导RAW264.7细胞炎症模型发现，槲皮素能够明显抑制TNF-α、IL-6等释放从而起到抗炎作用。

本研究发现半夏泻心汤治疗胃食管反流病的作用机制可能是通过参与基因表达的调控、凋亡过程的调控、细胞因子介导的信号通路等生物过程，调节酶结合、转录因子结合、染色质结合等分子功能，主要参与肿瘤信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等信号通路。分子对接结果表明，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素与关键靶点HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53的对接结合能均<-7 kcal·mol-1，结合稳定，初步验证半夏泻心汤中β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等核心成分可作用于HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53等关键靶点，通过参与相关通路来治疗GERD。STAT3在肿瘤及其微环境扮演十分重要角色[30-31]，研究发现，炎症因子IL-6通过激活STAT3通路导致食管腺癌的形成[32]。HIF1α名为缺氧诱导因子-1的α亚单位，与炎症反应密切相关[33]，赵东梅等[34]将40例RE患者均分为对照组和治疗组，分别给予PPI和PPI+中药治疗后发现，血清HIF1α表达水平均下降。孙颖等[35]研究发现，GERD患者体内HIF1α呈高表达状态，这与赵冬梅的研究结果基本相符。半夏泻心汤参与肿瘤通路，抑制相关STAT3通路的激活，减少炎症因子的释放，保护食管黏膜细胞，从而达到治疗GERD的目的。

本研究运用网络药理学和分子对接技术探讨半夏泻心汤治疗GERD的作用机制发现，半夏泻心汤可通过多成分、多靶点、多通路治疗GERD，但是本研究未结合相关实验验证其作用机制，具有一定的局限性，后续会进一步深入研究。