黄柳萍 梁庄严 吴伟彪 魏楚洪 罗小芳 吴海燕 郭润民 赵卓姝▲

1.广东医科大学顺德妇女儿童医院医学遗传实验室，广东佛山 528300；2.广东医科大学顺德妇女儿童医院新生儿疾病筛查中心，广东佛山 528300；3.广东医科大学顺德妇女儿童医院产前诊断中心，广东佛山 528300

在产前诊断工作中经常遇到嵌合体的情形，如何准确判断所观察到的嵌合现象属于真性嵌合还是假性嵌合，是困扰每一个产前诊断医生的难题。染色体核型是一种传统方法，通过计算核型的数量算出异常核型的比例来分辨嵌合体，该方法受培养过程的影响，也无法发现<5 Mb 的染色体异常，具有局限性。拷贝数变异测序（copy number variations-sequencing，CNV-seq）检测不需要进行细胞培养，分辨率高，但是无法检出纯合区域、单亲二倍体和染色体结构异常[1]。因此，两种方法的结合理论上可提高羊水嵌合体的诊断准确率。本研究纳入染色体核型联合CNV-seq 诊断嵌合体的病例，分析其诊断结果，为产前诊断中羊水嵌合体的诊断提供数据和经验支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2021年6月因各种高危因素于广东医科大学顺德妇女儿童医院（我院）产前诊断中心就诊并进行产前诊断的孕妇3163 例作为研究对象，收集所有的羊水染色体核型分析结果或CNV-seq 结果为嵌合体的病例进行分析。所有入选孕妇均签署知情同意书，该研究得到我院产前诊断中心医学伦理委员会批准。纳入标准：①单胎妊娠且孕周16～24 周；②有明确产前诊断指征，包括高龄、超声异常、唐氏筛查异常、不良孕产史等。排除标准：①多胎妊娠；②孕周<9 周；③近几个月有先兆流产者；④其他侵入性产前诊断有禁忌证者。所有入选孕妇接受由具有遗传咨询资质的临床医生提供详细遗传咨询，建立遗传咨询病例，记录孕妇的临床相关信息。所有孕妇均在超声定位后，在无菌条件下经腹壁行羊水穿刺术，取羊水20～25 ml 进行相关检测。

1.2 染色体核型分析

羊水离心后去上清，细胞悬液置于37℃ 5%CO2培养，带羊水细胞贴壁镜下见多个克隆即可进行收获。常规制片，G 显带，根据标准[2]，计数不少于20 个分裂相，分析5 个核型。根据人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）对所检染色体进行命名，依据判读指南对染色体结果进行分析和判读[3]。

1.3 CNV-seq检测

按照DNA 提取，DNA 文库构建与测序，生物信息学分析的流程进行CNV-seq 检测，分析并记录相关数据。

1.4 统计学分析

使用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验进行比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羊水嵌合体检出率

3163 例羊水检出嵌合体43 例，检出率为1.36%，其中染色体核型检出嵌合体40 例，检出率为1.26%，CNV-seq 检出嵌合体20 例，检出率为0.63%，染色体核型对嵌合体的检出率显著高于CNV-seq 对嵌合体的检出率（χ2=6.731，P=0.009）。

2.2 染色体核型联合CNV-seq对嵌合体的诊断

如表1所示，染色体核型与CNV-seq 检测结果相符率为39.53%（17/43），其中性染色体相符率为52.38%（11/21，21 为性染色体嵌合的病例数），大部分为45，X 嵌合体；常染色体相符率为27.27%（6/22，22 为常染色体嵌合的病例数），有8、12、13、16、21 号染色体嵌合。如表2所示，检测结果不相符26 例，其中10 例性染色体嵌合，最多的是45，X嵌合体，其次是47，XXX 嵌合体；16 例常染色体嵌合，有5、9、10、14、18、20、21 号染色体嵌合，而最多的是18 和21 号染色体嵌合。

表1 染色体核型与CNV-seq检测羊水嵌合体结果相符病例

表2 染色体核型与CNV-seq检测羊水嵌合体结果不相符病例

3 讨论

产前诊断过程中经常遇到嵌合体的情形，胎儿整个机体存在两种或以上的细胞系，称之为真性嵌合体，除此之外还经常因为母血污染、培养过程中的细胞畸变等原因出现假性嵌合体的情况[4-5]，可能会错误地引导孕妇引产，所以正确地分辨真假嵌合非常重要。目前，分辨真假嵌合主要有四种方法：①染色体核型分析。通过计数核型的数量算出异常核型的比例来分辨嵌合体。这种判断真假嵌合体的方法有个巨大的缺陷，有可能是异常细胞产生了畸变后进入羊水中，从而培养物中出现多种异常染色体核型，而误诊为真性嵌合体，也有可能是体外培养或制片过程中的染色体畸变的细胞较多，从而异常集落较多而误诊为真性嵌合体[6-7]。②通过孕晚期脐血细胞染色体核型分析来验证或者结合超声结果综合判断。相关研究表明，羊水嵌合体发生率在0.29%左右，用胎儿组织或脐血来验证，真嵌合体的比率只有62.5%[8]，而对性染色体嵌合的研究表明[9]，用脐血来验证羊水性染色体嵌合，真性嵌合体只占47.8%（11/23）。张玲玲等[10]推荐在孕晚期采集脐血进行复查，并结合超声结果排除妊娠假性嵌合体，取得一定效果。该方法具有明显的弊端，首先采集脐血具有一定的概率流产，增加了孕妇的风险，其次当发生低比例嵌合或性染色体嵌合时，超声影像不能及时诊断[11]。③用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）验证。付玉荣等[12]将FISH 应用于产前嵌合体的辅助诊断，8 例染色体核型嵌合体结果中有3 例与FISH 结果不一致。FISH 将荧光素标记核酸探针与待测样本中的核酸序列杂交，实验周期短，成功率高，但是特异性探针价格高，并不是所有医疗机构都有条件开展该项目，探针的局限性也决定其不能对染色体结构异常进行检测[13]，从而限制了该技术的应用。④应用CNV-seq 检测嵌合体，理想条件下可检测出低至5%的染色体非整倍体嵌合，临床条件下可检出超过10%的染色体非整倍体嵌合[14]，同时可以客观地检测出微缺失、微重复，不像核型分析那样主观观察和判断，可精确检测低至10～50 ng 的DNA 样本，具有很强的临床适用性。

本研究纳入染色体核型联合CNV-seq 诊断嵌合体的病例，分析结果显示，染色体核型和CNV-seq结果相符率只有39.5%（17/43），其中性染色体相符率为52.38%（11/21），崔科等[15]研究发现染色体核型联合CNV-seq 检测性染色体嵌合体的符合率为78.57%，虽高于本研究结果，但符合率仍有待提高。常染色体相符率仅为27.27%（6/22）。染色体核型检出而CNV-seq 未检出的原因很可能是因为低比例嵌合超出CNV-seq 的检测下限，特别是常染色体嵌合，染色体核型检出的嵌合比例都在6%以下（19、23 号病例除外，可能是细胞培养过程中异常细胞优势生长，或是染色体制片过程中随机收获到了更多的异常细胞，导致嵌合比例假性增高），18号病例mos 45，X[25]/46，X，psu dic（X）（q25）[31]属于X 单体嵌合结构异常的psu dic（X），整体数量还是相当于两条X 染色体，因此CNV-seq 不能检出。染色体核型未检出而CNV-seq 检出的嵌合体病例有3 例，均为常染色体嵌合，常染色体异常的细胞培养可能生长过程缓慢，所以导致染色体核型未检出而CNV-seq 检出。可见，染色体核型联合CNV-seq 诊断嵌合体，可确认一部分真性嵌合（检测结果一致时），可检出传统染色体核型未检出的嵌合体（病例28、29、30）。还有一部分检测结果不相符的病例可怀疑假性嵌合，可通过FISH 验证或孕晚期采集脐血进一步验证。从嵌合比例的分布上看，43 个病例中，染色体核型检出嵌合比例≥10%的病例有15例，其中13例与CNV-seq检测结果相符，2 例不相符；染色体核型检出嵌合比例<10%的病例有28 例，其中只有4 例与CNV-seq 检测结果相符，24 例不相符；可见低比例嵌合更容易造成检测结果不相符，更需要不同的方法来相互验证。CNV-seq 检出嵌合比例≥10%的病例有20 例，其中17 例与染色体核型检测结果相符，3 例不相符；而CNV-seq 检出嵌合比例<10%的病例为0，可能是临床条件下CNV-seq很难检出<10%的嵌合，与前人研究结果相符[14]。

本研究纳入嵌合体病例数量有限，有待进一步纳入更多病例以丰富临床数据。嵌合体的诊断一直是产前诊断中的难题，随着新技术的发展，可将染色体核型、CNV-seq、FISH、基因芯片等更多的技术应用于产前嵌合体的诊断中，将会获得更准确的结果。本研究通过染色体核型和CNV-seq 的联合诊断，提前确认真性嵌合，避免孕妇后期复查脐血，减少孕妇焦虑，为产前诊断与遗传咨询工作提供巨大帮助。