孙雷涛 刘立云 张文生

滨州医学院附属医院神经外科，山东滨州 256600

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是临床最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，具有高复发率、高增殖率及局部复发侵袭等特点。目前胶质母细胞瘤的治疗原则为在尽可能保留神经功能的基础上全切肿瘤，术后辅以放化疗等综合治疗[1]。然而由于血脑屏障和血瘤屏障的存在，化疗药物选择性低、渗透能力弱、入胞效率低及耐药性等限制了化疗效果。外泌体（exosomes）作为新型的药物携载体，体积小、易通过血脑屏障，同时还能进行膜修饰从而增强细胞特异性靶向作用。在免疫反应、安全性上有很大的优势[2]。本研究运用体外修饰的外泌体作为阿霉素的载体，通过靶向修饰携载化疗药物快速、高效、靶向地输送至胶质瘤细胞，增强细胞亲和力，减少非靶部位的聚集，抑制胶质瘤细胞的体外增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

U87MG 细胞系（中科院上海细胞生物学研究所）；转染试剂（美国Invitrogene 公司），引物由上海生工设计合成，阿霉素（美国Sigma 公司），荧光染剂PKH67（美国Invitrogen 公司），电穿孔仪（美国Invitrogen 公司），激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 凯基DMEM 完全培养基用于细胞培养，待U87MG 细胞融合程度达到85%～90%时进行细胞的传代培养，收集第6～8 代的细胞用于后续的实验。培养条件为37℃、5% CO2。

1.2.2 具有靶向作用外泌体的表达载体pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 的 构 建 以LAMP2 cDNA为模板设计引物：LAMP2 Xhol 上游引物序列：TCTCGAGATGGTGGTGTGCTTCCGCCT，LAMP2 Xhol下游引物序列：AACTAGTAAATTGCTCATATCCAGC。通过PCR 将Flag-iRGD 序列插入LAMP2 cDNA 的3’端，获得LAMP2-Flag-iRGD 融合基因，通过酶切，将该融合基因克隆至pCDNA3.1 真核表达载体中，获得载体pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD。

1.2.3 U87MG 细胞转染 应用转染试剂（Lipofectamine 3000）将质粒转染入U87MG 胶质瘤细胞（空白转染组：pCDNA3.1/LAMP2；iRGD 靶向转染组：pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD）。将A 液、B 液混匀后悬滴加入六孔板中，标记空白转染组、iRGD 靶向转染组，将培养板摇动并轻轻混匀。6 h后更换去外泌体完全培养基。

1.2.4 外泌体的提取 去外泌体完全培养基（超速离心120 000 g，16 h）继续培养24 h 后收集上清，提取外泌体。反复超速离心后沉淀即为外泌体和杂质蛋白；最后用PBS 将沉淀重悬后继续在4℃下100 000 g 离心70 min，最后得到的沉淀即为细胞外泌体。分别获得空白转染-外泌体（blank-exo）组和iRGD-外泌体（iRGD-exo）组。

1.2.5 药物包装 将纯化的外泌体与阿霉素在PBS 中混合，将混合物在37℃摇动温育1 h，然后添加到冷却的4 mm 电穿孔比色杯中，用Eppendorf Eporator 在1 kV 下电穿孔混合物20 ms，分别获得空白转染-外泌体-阿霉素（blank-exo-dox）组、iRGD-外泌体-阿霉素（iRGD-exo-dox）组。

1.2.6 iRGD 的RT-PCR 检测 取冻存blank-exo组、iRGD-exo 组抽提RNA，进行反转录PCR 反应（iRGD 上游引物序列：5’-TCGATGTTAGACCTGG AAATAGTGGTGCTGTG-3’，iRGD 下游引物序列：5’-CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA-3’，GAPDH 设为内参）。

1.2.7 激光共聚焦观察细胞对外泌体的摄取及阿霉素的胞内浓度 PK67 分别标记blank-exo-dox组和iRGD-exo-dox 组，标记的外泌体沉淀用过滤PBS 重悬洗涤，将两组悬液分别悬滴加入U87MG细胞培养皿中，共孵育2 h 后，用PBS 液清洗并去除多余外泌体，分别得到blank-exo-dox-U87MG 和iRGD-exo-dox-U87MG。激光共聚焦下观察细胞对外泌体的摄取情况及外泌体携载阿霉素进入细胞的情况。

1.2.8 细胞增殖检测 将blank-exo-dox-U87MG和iRGD-exo-dox-U87MG 细胞分别接种于96 孔板，37℃、5% CO2培养0、24、48、72 h，然后加入10 μl的CCK-8 溶液后继续培养1～4 h，在450 nm 处用酶标仪测定观察吸光度。

1.3 统计学方法

使用SPSS 24.0 统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用独立样本的t检验及单因素方差分析，P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 iRGD-外泌体鉴定

通过RT-PCR 观察iRGD 修饰组mRNA 的表达水平。结果显示，细胞转染pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 后获取的外泌体中iRGD mRNA 高表达，而blank-exo 组未见表达（图1）。

2.2 iRGD-外泌体-阿霉素靶向U87MG细胞并增加胞内阿霉素浓度

iRGD 能够与胶质瘤细胞上αν 整合素靶向结合，共孵育后激光共聚焦观察发现iRGD-exo-dox 组与胶质瘤细胞的结合率为（45.60±9.15）%，显著高于blank-exo-dox 组的（9.20±3.46）%，差异有统计学意义（t=6.428，P=0.003）。说明通过以多肽为标靶的iRGD 显著增强了外泌体对U87MG 细胞的靶向能力（图2）。iRGD-exo-dox 组阿霉素主要聚集在U87MG 细胞核内，而在对照组，阿霉素富集低得多，且多位于细胞周边（图3）。

2.3 iRGD-外泌体-阿霉素抑制U87MG细胞增殖

通过CCK-8 分别检测blank-exo-dox 组和iRGD-exo-dox 组在24、48、72 h 时细胞的生长情况。blank-exo-dox 组在450 nm 处OD 值分别为（0.91±0.13）、（0.79±0.11）和（0.67±0.08）。iRGD-exo-dox组 在450 nm 处OD 值 分 别 为（0.55±0.12）、（0.34±0.08）和（0.17±0.06）。iRGD-exo-dox 组抑制率分别为（52.33±8.94）%、（70.15±6.20）% 和（87.16±13.01）%，但blank-exo-dox 组抑制细胞增殖能力较弱，分别为（18.41±3.69）%、（27.82±5.10）%和（37.31±6.39）%，两组同一时间点比较差异均有统计学意义（P< 0.05），表明iRGD-exo-dox 高效靶向U87MG 细胞后通过增加胞内阿霉素浓度显著抑制了细胞增殖（图4）。

3 讨论

脑胶质瘤术后化疗对延长患者生存的意义重大，但目前总体治疗效果仍不甚理想[3-4]。影响化疗效果的原因主要为血-脑屏障的存在和肿瘤细胞的耐药性及免疫逃逸[5]。胶质瘤中存在的肿瘤干细胞有多种分化能力，有良好的免疫逃逸机制，耐药机制较为复杂。目前，传统化疗药物特异性差、耐药率高、人体毒性作用强，越来越多的研究集中于药物的靶向性及耐药机制的研究[6]。因此寻找小分子量、高穿透性药物载体来提高局部药物浓度及靶向作用，成为目前研究的热点。

传统细胞靶向载体存在运载效率低，具有免疫原性易被清除，缺乏靶向性等问题，难以实现对药物携载的稳定性和特异性。外泌体作为30～100 nm的脂质双分子囊泡，携带蛋白及核酸物质，在免疫反应、安全性上有很大优势：体积小，易通过血脑屏障；作为一种膜结构载体，通过膜融合方式直接送入靶细胞中，投递效率更高。不仅在体内、体外均可以加载基因和药物，同时还能进行细胞膜的修饰从而增强细胞抗原特异性的靶向作用。外泌体有望成为化疗药物的“金载体”[7]。

国外有研究发现外泌体通过携载β 分泌酶siRNA 后外泌体的血脑屏障穿透率明显提高，而且肿瘤周围的小胶质细胞、少突胶质细胞甚至神经元中BACE1 的表达均显著抑制[8]。近年来，关于外泌体中内容物表达的研究进一步揭示了脑胶质瘤的侵袭转移机制，为脑胶质瘤的化疗耐药机制研究、免疫治疗、靶向治疗等开阔了思路[9]。有研究在斑马鱼胶质瘤模型中发现，大脑内皮细胞来源的外泌体作为载体可以携带抗肿瘤药物穿过血脑屏障，治疗多种中枢神经系统恶性肿瘤包括胶质瘤[10]。有研究在胶质瘤中，证明了组建的工程外泌体能够顺利通过血脑屏障，不仅具备良好的靶向治疗效果，毒副作用明显降低[11]。

研究已证实整合素ανβ3 在胶质瘤的血管生成过程中表达增加，而且在胶质瘤细胞株细胞膜上也高表达[12]。有研究应用RGD 序列多肽作为PET-CT 检查的显像剂来观察不同肿瘤细胞的结合特性，结果显示：胶质瘤对RGD 的摄取率>肝癌、胰腺癌>肠癌、子宫颈癌[13]。有研究发现，iRGD 能特异识别肿瘤细胞和肿瘤内新生血管的内皮细胞中表面高表达的整合素ανβ3 分子[14]。理论上iRGD-外泌体-阿霉素药物载体就可以携带阿霉素快速、高效、靶向地输送至胶质瘤细胞内和瘤内血管内皮细胞，减少其非靶部位的聚集。

虽然阿霉素作为常用的抗肿瘤药物，在多种恶性肿瘤的治疗中应用，但由于其剂量毒性及血脑屏障的限制，在中枢神经肿瘤的应用较少[15]。目前有研究者提出了外泌体作为化疗药物（紫杉醇和阿霉素）和中药姜黄素的运载工具，提高药物治疗效果[16]。充分设计和利用人自身纳米级的药物载体，不仅具有良好的免疫原性，同时具备良好的靶向转载药物能力，表现出了良好的应用前景[17]。在本研究中通过转染iRGD 的外泌体包裹阿霉素成功构建了药物载体，作用于U87MG 细胞后表现出良好的靶向性，并且能够显著抑制U87MG 细胞的增殖。

目前大量的实验研究发现，外泌体同时参与了细胞间的通讯、免疫应答、免疫豁免等细胞功能，因此，在恶性肿瘤的发生发展各个病理阶段均有参与[18]。近年来外泌体作为基因表达调控、免疫稳态维持、细胞通信等方面的研究热点，取得了一定的进展，但中枢神经系统肿瘤中外泌体的研究仍处于起步阶段[18-19]。目前研究认为建立特殊的实验模型、大通量基因组学及蛋白组学中探寻特异性液体活检靶向分子、开发新的外泌体-抗肿瘤药物载体是未来中枢神经系统肿瘤外泌体研究的方向和重点[20]。