马淑芹 王谦 徐强 贺梦婷 林静

(青岛大学附属医院眼科，山东 青岛 266003)

真菌性角膜炎(fumigatus keratitis, FK)是一种由致病真菌引起的感染性角膜疾病[1]。曲霉菌属及镰刀菌属是发展中国家FK的主要致病菌[2]。目前临床上常用的抗真菌药物如那他霉素、伏立康唑等普遍出现耐药性[3]，因此寻找治疗FK安全有效的新型药物具有重要意义。在FK的发生发展过程中，除真菌的毒力因子(如毒素和蛋白酶等)对角膜造成直接损伤外，真菌在角膜组织中还能诱导强烈的免疫炎症反应，加重角膜组织损伤[4-8]。目前临床上抗真菌治疗结合免疫调节在真菌感染性疾病治疗中效果较好。扁柏酚(HK)是一种天然的卓酚酮衍生物，从柏科植物的树干中纯化而来[9]。既往研究表明，在聚肌胞苷酸刺激的人角膜上皮细胞中，HK可以抑制核转录因子-κB的核转位和促炎炎症因子的表达，保护角膜上皮细胞免受损伤[10]。在大脑中动脉闭塞诱导的血栓栓塞性卒中大鼠中，HK可以通过抑制炎症反应和细胞凋亡，起到神经保护的作用[11]。HK抗真菌效果显著，可以通过阻断RAS信号传递来抑制白色念珠菌的菌丝生长[12]，还能抑制念珠菌生物膜生长[13]。但HK对FK的作用及其作用机制目前尚未见相关研究报道。本研究拟通过动物实验和体外细胞实验，探讨HK在烟曲霉菌所致FK中发挥的保护作用及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 烟曲霉菌培养和HK溶液的配置

取低温保存的烟曲霉菌标准菌株(菌株3.0772，中国微生物中心)，接种于固体琼脂培养基后置于28 ℃培养箱孵育，待菌丝覆盖培养基表面，刮取孢子，用无菌PBS调整孢子终浓度至1×1010CFU/L，分为两份。一份储存于4 ℃冰箱备用。另一份接种于装有无菌沙氏培养基的锥形瓶中，28 ℃下于培养箱内振荡培养；待菌丝呈圆团状时，收集菌丝研磨离心，加入体积分数0.75的乙醇灭活菌丝，4 ℃冰箱放置过夜；洗除乙醇后，加入DMEM培养液调整灭活菌丝终浓度至5×109CFU/L。取适量HK粉末溶解于DMSO并调整浓度至32 g/L后储存，后续通过无菌PBS或者DMEM细胞培养基将HK储存液稀释至合适的工作液用于实验。

1.2 小鼠的分组和处理

8周龄雌性C57BL/6小鼠24只(购于北京斯贝福生物技术有限公司)，随机分为HK组和对照组，每组12只。小鼠以80 g/L水合氯醛0.08 mL腹腔注射麻醉，于小鼠右眼角膜基质内注入2 μL烟曲霉菌分生孢子混悬液(1×1010CFU/L)，左眼不做任何处理。于小鼠感染真菌后第1天，HK组小鼠给予5 μL HK(10 mg/L)点眼处理，对照组小鼠给予1 g/L DMSO点眼处理，每日3次，两次点眼间隔4 h。

分别于真菌感染后第1天和第3天使用裂隙灯观察两组小鼠右眼角膜炎症情况，参考相关文献对小鼠角膜炎症进行临床评分[14]，分为Ⅰ～Ⅳ级，分别对应1～4分。于感染真菌后第3天，以颈椎脱臼法处死所有小鼠。收取每组6只小鼠的右眼角膜，置于500 μL无菌PBS中研磨匀浆，取100 μL匀浆液均匀接种于沙氏固体琼脂培养基中，37 ℃下孵育36 h后，计数菌落形成单位(CFU)数目，每组重复6次，依据角膜CFU数目定量分析角膜真菌负荷量。收取每组另外6只小鼠眼球，包埋于OCT包埋剂中，液氮速冻后使用冰冻切片机(-25 ℃)10 μm厚切片，切取位置为角膜中央部位。每只小鼠的切片分为3份，一份进行HE染色，一份进行过碘酸希夫(PAS)染色，均于光学显微镜下观察并拍照记录；另外一份切片进行巨噬细胞免疫荧光染色，使用荧光显微镜观察拍照。以上实验步骤均严格按照产品使用说明书操作。

1.3 细胞培养及处理

将小鼠RAW264.7巨噬细胞(购买于中国科学院细胞库)置于37 ℃含体积分数0.05 CO2的DMEM细胞培养液中，接种在12孔细胞培养皿中培养。待细胞密度达到约80%时，C组给予1 g/L DMSO预处理2 h，D组和E组细胞分别给予浓度8、16 mg/L的HK预处理2 h，A组和B组细胞不做预处理；上述处理完成后分别于B～E组每孔细胞中加入灭活菌丝60 μL处理8 h。然后收集各组细胞，采用Trizol法提取常规培养的细胞总RNA,逆转录合成cDNA,并以此为模板进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。根据试剂盒说明书配制反应体系,以β-actin作为内参照,每个样品设置4个复孔，结果取均值，实验重复3次。采用2-△△CT法计算样本当中IL-1β、MCP-1、CXCL-1以及Dectin-1 mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物名称及序列

1.4 统计学处理

采用SPSS 统计软件对实验数据进行分析。各组间比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组小鼠角膜炎症情况比较

裂隙灯图像显示，在烟曲霉菌感染后第1天，HK组与对照组小鼠角膜炎症程度无明显差别(图1A、B)；烟曲霉菌感染后第3天，与对照组相比，HK组小鼠的角膜混浊面积明显减少，溃疡程度明显减轻，角膜透明度明显增加(图1C、D)。HE染色结果显示，与对照组相比，HK组小鼠角膜在烟曲霉菌感染后第3天炎症细胞数量明显减少，溃疡程度明显减轻(图1E、F)。对照组和HK组小鼠第1天角膜炎症的临床评分分别为5.67±0.52、5.83±0.41，第3天角膜炎症的临床评分分别为7.67±0.52、5.33±0.52。重复测量设计的方差分析结果显示，时间、分组以及时间和分组的交互作用对小鼠角膜炎症的临床评分均有明显影响(F时间=19.29，F分组=22.84，F交互作用=53.57，P<0.05)；单独效应分析，第3天对照组小鼠角膜炎症临床评分与第1天相比明显提高(P<0.05)，在第3天HK组小鼠角膜炎症的临床评分与第1天相比较无明显变化(P>0.05)；两组小鼠角膜炎症临床评分在烟曲霉菌感染后第1天无显著差异(P>0.05)，感染第3天HK组小鼠角膜炎症临床评分较对照组显著降低(P<0.05)。

A、B分别为对照组和HK组小鼠感染后第1天裂隙灯图像，C、D分别为对照组和HK组小鼠感染后第3天裂隙灯图像，E、F分别为感染后第3天对照组和HK组角膜组织HE染色图像(400倍)

2.2 两组小鼠角膜真菌负荷比较

结果显示，烟曲霉菌感染后第3天，对照组和HK组小鼠角膜CFU计数分别为329.00±28.76、98.17±6.77，两组比较差异具有显著的意义(F=366.23，P<0.05)。角膜组织切片的PAS染色结果显示，在感染后第3天，对照组角膜基质层可见较多烟曲霉菌菌丝(图2A)，HK组角膜基质层菌丝含量较对照组显著减少(图2B)。

A、B分别为对照组和HK组小鼠感染后第3天PAS染色结果(400倍)，其中右下角图为放大的角膜基质(800倍)，白色箭头指示烟曲霉菌菌丝

2.3 两组小鼠角膜组织中巨噬细胞浸润情况比较

小鼠角膜组织的巨噬细胞免疫荧光染色结果显示，烟曲霉菌感染后第3天，两组小鼠角膜基质中均有大量巨噬细胞浸润，与对照组相比，HK组角膜组织中巨噬细胞浸润数量显著减少(图3)。其中图中绿色图像为使用F4/80-FITC标记的巨噬细胞，蓝色图像为使用DAPI标记的细胞核，Merge指示巨噬细胞在角膜组织中的定位。

A、B分别代表感染后第3天对照组、HK组小鼠角膜巨噬细胞免疫荧光染色结果(400倍)

2.4 各组细胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1和Dectin-1 mRNA表达水平比较

RT-qPCR检测的结果显示，各组细胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1及模式识别受体Dectin-1 mRNA的相对表达水平进行比较，差异具有显著意义(F=90.80～370.57，P<0.05)，其中B组显著高于A组(P<0.05)，B组与C组间比较没有明显差异(P>0.05)，D、E组明显低于B组(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞IL-1β、MCP-1、CXCL-1和Dectin-1 mRNA表达水平比较

3 讨 论

FK是由致病真菌引起的一种高度致盲的感染性眼病[15]。致病真菌的侵袭性强、毒力大，可介导机体产生各种趋化因子及炎症因子，招募炎症细胞向感染部位聚集[16]。过度的免疫炎症反应，常常会造成严重的角膜损伤，严重者可导致角膜穿孔[17-18]。HK是一种在柏科植物中发现的天然卓酚酮类衍生物，具有广泛的抗真菌及抗炎作用[19]。

本研究结果显示，与对照组相比，HK处理烟曲霉菌感染的小鼠角膜3 d后，角膜混浊面积减少，溃疡程度减轻，角膜透明度增加，临床评分显著降低。HE染色结果也显示HK处理的小鼠角膜炎症细胞数量减少，溃疡程度减轻。提示HK能够减轻烟曲霉菌致角膜炎的炎症反应，降低角膜损伤。烟曲霉菌在侵袭角膜的过程中，可以通过其黏附素黏附于角膜上皮基底膜、胶原等成分上，其分泌的磷脂酶可造成宿主上皮细胞膜损伤，进而导致细胞肿胀、坏死[20]。因此，降低角膜真菌负荷量能够减轻角膜炎症程度。体外实验研究显示，HK对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有显著抑菌作用[12-13,21]。HK可以显著降低肺炎链球菌肺炎模型小鼠肺部细菌负荷[22]。在本研究中，使用HK处理烟曲霉菌感染的小鼠角膜，在感染后第3天小鼠角膜真菌残存量显著降低。提示HK能有效抑制烟曲霉菌的生长，从而减轻角膜烟曲霉菌感染症状。

巨噬细胞是FK感染过程中免疫应答的重要成分，其能够识别并吞噬病原体，诱导ROS、一氧化氮等抗真菌物质的产生，从而直接杀伤真菌，还可以诱导各种炎症因子的产生，介导免疫细胞的进一步活化[23-24]。巨噬细胞所产生的这些抗真菌物质在清除真菌的同时，也能溶解角膜基质，导致角膜组织坏死和脓肿发生[25]。既往研究表明，在铜绿假单胞菌感染性角膜炎小鼠模型中，向角膜内注射乳胶微粒活化巨噬细胞后，小鼠角膜炎症程度显著加重，过量的巨噬细胞浸润还会导致角膜穿孔[26]。本研究对真菌感染的小鼠角膜给予HK处理后，检测巨噬细胞在角膜基质中的浸润程度，结果显示HK组小鼠角膜基质中巨噬细胞的浸润数量较对照组明显减少，提示HK抑制了巨噬细胞在角膜组织中的募集，从而在FK中发挥抗炎作用。为了观察HK能否调控巨噬细胞中炎症相关因子的产生，本研究分别使用DMSO和不同浓度的HK预处理RAW264.7巨噬细胞，再加入烟曲霉菌灭活菌丝刺激上述细胞，检测各组细胞炎症因子和趋化因子表达的变化。结果示HK预处理组RAW264.7细胞中IL-1β、MCP-1、CXCL-1的表达水平与对照组比较明显降低，提示HK能抑制烟曲霉菌诱导的巨噬细胞中炎症因子和趋化因子的表达，从而进一步减少免疫细胞的募集。LU等[27]研究显示，HK通过抑制肝组织中炎症因子的表达，可有效防止出血性休克及复苏后的肝损伤。LEE等[28]研究显示，HK能通过抑制脂多糖诱导的原代人角质形成细胞中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达水平，从而减轻皮肤炎症损伤。上述研究与本研究结果一致。在FK中，Dectin-1受体的激活可以诱导大量炎症因子和趋化因子，进而促进巨噬细胞和中性粒细胞的进一步激活以及ROS的产生，加速炎症级联反应[29]。为了进一步探究HK在FK中发挥抗炎作用的机制，本研究检测了烟曲霉菌感染后RAW264.7巨噬细胞中Dectin-1的表达。结果显示HK预处理组Dectin-1的基因表达较对照组明显降低。提示当角膜受到烟曲霉菌感染时，HK可通过抑制Dectin-1 mRNA表达及其介导的下游炎症反应来抑制过度炎症反应的发生。

综上所述，本研究结果显示,HK在烟曲霉菌性角膜炎中具有抗真菌和抑制炎症的作用，其作用机制为，一方面HK可减少角膜真菌负荷量，另一方面HK能够抑制巨噬细胞募集以及Dectin-1受体介导的下游炎症级联反应。本研究结果为进一步探索HK针对FK的临床试验提供了理论依据和实验数据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学附属医院动物伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL-26776)。所有实验过程均遵照美国眼科和视觉研究协会(ARVO)关于在眼科和视觉研究中动物使用的原则和标准进行。

EthicsApprovalandAnimalRight：All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee on Experimental Animals of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Approval Letter No.QYFYWZLL26776), and all experimental animal protocols were carried out by The Guidelines of The Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)State-ment for The Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research.

作者贡献：马淑芹、贺梦婷、林静参与了研究设计；马淑芹、王谦、徐强参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：The study was designed byMAShuqin,HEMengting, andLINJing.The manuscript was drafted and revised byMAShuqin,WANGQian,andXUQiang.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.