丁娜 袁阳 王明山 张高峰 陈怀龙 时飞 孙晓鹏

(1 青岛大学附属青岛市市立医院麻醉科，山东 青岛 266071； 2 青岛市西海岸新区区立医院麻醉科)

目前，人群中缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)的发病率、致死率、致残率均较高[1]，急性期溶栓是较为有效的治疗方法，但恢复脑血流会导致缺血再灌注(I/R)损伤[2]，其中细胞线粒体是该病理过程的中继站和放大器，维持线粒体形态功能对细胞的存活至关重要[3]。本课题组前期研究结果显示，电针预处理可抑制大鼠脑I/R时皮质神经细胞的线粒体分裂，减少神经细胞凋亡，发挥脑保护作用[4]。线粒体融合蛋白2(Mfn2)分布于线粒体外膜，在线粒体融合分裂中发挥着重要作用，可以调控线粒体的形态和功能[5]。因此，本研究通过分析电针预处理对大鼠I/R时脑皮质缺血半暗区神经细胞线粒体上Mfn2蛋白表达的影响，以进一步探讨电针预处理对大鼠脑I/R损伤可能的影响机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组

清洁级健康雄性SD大鼠93只，8～12周龄，体质量200～300 g，购自青岛大任富城畜牧有限公司[许可证号：SCXKL(鲁)2014-007]。在标准动物房内饲养，温度20～25 ℃，12-12 h明暗交替环境。将大鼠随机分为假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、电针预处理组(E组)，每组31只。

1.2 各组大鼠的处理

S组大鼠仅暴露颈部血管，不进行阻闭。I/R组用线栓法[6]制作大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型。E组于造模前连续5 d电针刺激大鼠百会穴[4]，最后一次针刺结束24 h后同I/R组处理。

1.3 大鼠神经功能缺损评分的评定

于再灌注6、24、48 h时随机取9只大鼠，按Longa评分法对其行神经功能缺损进行评分[7]，1～3分为造模成功。造模成功后行以下指标检测。

1.4 大鼠神经细胞凋亡率的计算

按照Tunel试剂盒(碧云天生物科技研究所)说明书要求的步骤检测大鼠神经细胞凋亡情况[8]。于再灌注6、24和48 h时随机选取4只大鼠，断头取脑，取左侧脑皮质缺血半暗区组织制作石蜡切片，选用二甲苯、乙醇脱蜡，蛋白酶K消化，PBS冲洗后置入过氧化氢溶液中孵育，DAB显色后切片。细胞核呈棕褐色的为Tunel细胞，即凋亡神经细胞。参照相关文献[9]计算大鼠神经细胞凋亡率：在各组玻片组织中随机选取5张切片，于400倍光镜下拍照，利用IPP 6.0软件计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=Tunel细胞数量/细胞总数×100%。

1.5 大鼠标本细胞形态学观察

于再灌注24 h时随机取4只大鼠，以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mg/kg)后，生理盐水灌注循环系统，直至心耳变为白色，右心房流出的液体由血色变为清澈。灌注固定后，取脑皮质缺血半暗区，剪成约1 mm3的小块，浸入 30 g/L戊二醛前中固定，10 g/L 锇酸后固定；梯度乙醇脱水后，浸透、包埋、切片；常规醋酸铀和柠檬酸铅染色，通过透射电镜观察神经细胞中线粒体超微结构的变化。

1.6 Western blot 法检测脑皮质缺血半暗区神经细胞线粒体上Mfn2及胞浆中Cyt C的表达水平

于再灌注6、24和48 h时每组随机取5只大鼠，断头取脑，取缺血半暗区脑组织，4 ℃条件下制成匀浆。用组织线粒体分离试剂盒(碧云天生物科技研究所)采用差速离心法分离线粒体和胞浆[10]。提取的线粒体加入线粒体裂解液离心后取上清液，上清液含线粒体蛋白。然后配置10%和5%丙烯酰胺的分离胶和浓缩胶，加样线粒体上清液蛋白或胞浆蛋白进行电泳浓缩、分离，半干法转移到PVDF膜上，印迹膜封闭2 h后，线粒体上清液蛋白中加入Mfn2一抗(稀释度1∶1 000，上海恪敏生物科技公司)，胞浆蛋白中加入Cyt C一抗(稀释度1∶1 000，上海恪敏生物科技公司)。室温孵育1 h后，TBST洗膜，曝光、洗片。以IMAGE J软件分析灰度值，Mfn2以COX-IV作为内参照，Cyt C 以β-actin作为内参照，Mfn2和Cyt C分别与其内参照蛋白灰度值的比值表示相对表达量。

2 结 果

2.1 3组大鼠神经功能缺损评分比较

时间、时间与分组交互作用对大鼠神经功能缺损评分均无明显影响(P>0.05)，分组对神经功能缺损评分有明显影响(F=235.53，P<0.05)。与S组比较，I/R组和E组3个时间点的神经功能缺损评分均显著升高(F=79.17～109.35，P<0.01)；与I/R组比较，E组3个时间点神经功能缺损评分均显著降低(P<0.01)。见表1。

2.2 3组大鼠神经细胞凋亡率比较

时间、分组、时间与分组交互作用对神经细胞凋亡率有明显影响(F=13.71～328.20，P<0.05)。组内3个时间点比较，I/R组和E组神经细胞凋亡率差异均有显著性(F=28.08、30.82，P<0.01)。组间比较，在3个时间点I/R组和E组神经细胞凋亡率均显著高于S组(F=30.79～213.91，P<0.01)，E组均显著低于I/R组(P<0.01)。见表1。

2.3 各组大鼠大脑皮质缺血区神经细胞线粒体上Mfn2及胞浆中Cyt C蛋白水平比较

时间、分组、时间与分组交互作用对线粒体上Mfn2及胞浆中Cyt C蛋白水平均有明显影响(F=22.00～2 019.71，P<0.05)。组内3个时间点比较，I/R组和E组线粒体上Mfn2表达水平比较差异均有显著性(F=181.57、19.64，P<0.01)，I/R组和E组胞浆中Cyt C蛋白水平比较差异均具有显著意义(F=87.29、54.40，P<0.01)。组间比较，在3个时间点I/R组和E组线粒体上Mfn2表达水平均显著低于S组(F=94.86～453.95，P<0.01)，E组均显著高于I/R组(P<0.01)；组间比较，在3个时间点I/R组和E组胞浆内Cyt C蛋白水平均显著高于S组(F=279.81～1 297.13，P<0.01)，E组均显著低于I/R组(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠不同时间点相关指标比较

2.4 3组大鼠大脑皮质缺血半暗区神经细胞线粒体超微结构比较

电镜下S组神经细胞中线粒体呈短棒状，结构清晰完整。I/R组和E组中可见不同程度的线粒体分裂，膜间隙肿胀，基质包含物沉积，空泡形成，嵴模糊或消失，与I/R组比较E组病变较轻(图1)。

A：S组，B：I/R组，C：E组。枸橼酸铅电子染色，100 000倍

3 讨 论

研究显示，电针预处理可激发机体适度应激，合成和释放一些内源性保护物质进行自我反馈调节，以维持机体内环境的稳定，通过多通道、多靶点诱导脑缺血耐受，改善脑I/R损伤[11]。但其机制尚未完全阐明，本研究从Mfn2介导的线粒体形态改变出发，进一步探讨电针预处理的脑保护机制。

本研究中，通过短暂栓塞大鼠大脑中动脉，制备大鼠脑I/R损伤模型，再灌注后大鼠神经功能缺损评分升高，大脑皮质缺血半暗区神经细胞凋亡率增高，说明模型制备成功。电针预处理后，神经功能缺损评分降低，神经细胞凋亡率降低，提示电针预处理减轻了大鼠脑I/R损伤。

线粒体为细胞提供能量，并可通过交换基因组促进细胞修复[12]。生理状态下线粒体不断融合分裂，并依靠融合分裂平衡来维持其稳态和正常功能，其中Mfn2是调节线粒体融合分裂水平的重要蛋白之一[13]。细胞代谢过程中，线粒体分裂和融合在维持细胞功能中起关键作用。ROCHA等[14]的研究显示，Mfn2基因突变引起线粒体形态结构缺陷，从而诱发遗传性的2A型Charcot-Marie-Tooth病。HAN等[15]的研究也发现，Mfn2缺失会引起细胞凋亡。既往研究表明，在I/R等应激状态下，小鼠脑皮质神经细胞线粒体融合减少，分裂增加，膜电位消失，通透性转换孔开放，膜间隙中的Cyt C等促凋亡递质释放增加，最终导致细胞凋亡[16]。Cyt C是第一个被证明在凋亡细胞线粒体中释放的蛋白，线粒体中Cyt C的释放，导致细胞的不可逆凋亡。本研究结果显示，电镜下I/R时大鼠大脑皮质缺血半暗区神经细胞线粒体形态改变，膜间隙肿胀，空泡形成，嵴模糊或消失,Cyt C释放增加，神经细胞凋亡率增加，而电针预刺激后线粒体肿胀变形减轻，双层膜结构较完整，嵴形态和数目趋于完整，Cyt C释放减少，神经细胞凋亡率减低。提示电针预刺激会提高神经细胞对I/R的耐受。

研究显示，PBDE-47可诱导PC12细胞产生神经毒性，而促进线粒体融合通过恢复线粒体稳态和抑制过度细胞凋亡减轻PBDE-47损伤[17]。与青年小鼠相比，老年大鼠肝脏因缺乏Sirt1和Mfn2表达，更容易遭受I/R损伤[18]。在细胞凋亡的过程中，Mfn2的表达及其水平能反映细胞凋亡的程度。ZHANG等[19]的研究结果显示，特异性靶向缺失Mfn2会导致线粒体端粒缩短，从而增加细胞凋亡。PATRUSHEV等[20]研究显示，抑制Mfn2表达后，线粒体形态大小不一，各不相同，碎片化程度加重。本研究中I/R损伤后细胞线粒体上Mfn2表达水平下降，线粒体融合降低，Cyt C释放增加。而经过电针预处理，大鼠在同样经历I/R损伤后，细胞线粒体上Mfn2表达下降程度降低，线粒体形态改变减轻，Cyt C释放减少。

综上所述，电针预处理大鼠百会穴可以减轻脑I/R损伤后神经损伤症状，减轻细胞凋亡，其脑保护机制可能与上调Mfn2表达，增强线粒体融合有关。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学部伦理委员会的审核批准(批准号2019008)。所有实验过程均遵照《医学实验动物管理实施细则》进行。

EthicsApprovalandAnimalRight: All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Ethics Committee of Qingdao University Faculty of Medicine(Approval Letter No.2019008).All experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Implementation Rules for The Management of Medical Laboratory Animals.

作者贡献：丁娜、袁阳、时飞、孙晓鹏、王明山参与了实验设计；丁娜、张高峰、陈怀龙参与了论文写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该最终稿件。

Contributions: The study was designed byDINGNa,YUANYang,SHIFei,SUNXiaopeng, andWANGMingshan.The manuscript was drafted and revised byDINGNa,ZHANGGaofeng, andCHENHuailong.Model establishment and indicators detection were implemented by.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.