魏玥杉，丛敬

（1.沈阳医学院基础医学院2018级临床医学专业，辽宁 沈阳110034；2.基础医学院组织学与胚胎学教研室）

在肾脏生理中，肾单位的上皮细胞在水和溶质的转运以及维持稳态方面具有重要作用。跨上皮物质转运可以通过跨细胞和细胞旁路途径来实现，而细胞旁路的通透性与紧密连接（tight junction，TJ）密切相关［1］。TJ是位于上皮细胞侧面最顶端的细胞连接，由跨膜蛋白、胞质支架蛋白和信号蛋白构成。跨膜蛋白因其细胞外结构域伸入到细胞间，进而影响细胞旁路溶质运动，成为决定细胞旁路通透性的关键因素，其中Claudins是TJ中最丰富的跨膜蛋白［1］。本文就Claudins的结构及其生理功能的研究进展及其在健康和肾脏疾病中的作用进行综述。

1 Claudins的分类和结构

Claudins的分子量为22~25 kDa，有26个（人类）或27个（啮齿类）亚型［2］，特异性地表达在上皮细胞和内皮细胞中。Claudins 1-10，-14，-15，-17和-19共享序列同源性且功能相似，常常被称为经典Claudins［3］。Claudins由4个跨膜结构域、2个胞外环（ECL1和ECL2）、位于细胞质侧的-N末端和-C末端以及一个短的细胞质内转折组成［4］。在同一细胞Claudins彼此相互作用形成顺式二聚体，或更高的寡聚状态，然后相邻细胞的Claudins之间反式配对延伸，以此将Claudin寡聚体组装成TJ链。冷冻蚀刻及电子显微镜技术显示，TJ链呈线样或条索状，彼此连接吻合成迷路样的网格结构［5］。

2 Claudins的功能

2.1 Claudins的屏障功能 Claudin-1在肾小囊壁层上皮细胞（parietal epithelial cells，PECs）的TJ中表达，PECs被认为可以限制经血管球过滤后的蛋白质逃逸到肾小体周围空间。PECs间的TJ与细胞底部的基膜一起成为尿液滤过的第二道屏障［6］。Ohse等［7］在实验性诱导肾小球肾炎后，发现TJ蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin表达水平降低，相邻PECs间对与白蛋白大小相似的示踪剂的通透性增加。

几个过表达研究将Claudin-1、-3、-5、-11、-14和-19划分为屏障型Claudins［8-10］。但这类研究的解释很复杂，与跨膜转运蛋白不同，Claudins在实验中同时发挥屏障和孔道的作用，且所有的上皮细胞已经表达了多个内源性的Claudins，外源性表达（或被敲除）的Claudins的功能必须叠加在这个背景上。因此，Claudins的表观功能高度依赖于宿主细胞系的特性。

2.2 Claudins的转运功能 Claudins可以选择性地增加细胞旁路的阳离子或阴离子的通透率。相关研究已经建立了Claudins形成的细胞旁路通道的模型，这是一类直径为4~7Å的新通道，定向垂直于组织平面，连接细胞顶底两侧区室［11］。每一段肾小管节段都相应地表达特定的Claudins，这些Claudins赋予该节段独特的细胞旁路通透性和选择特性。研究表明，Claudin-4、-5、-8、-11和-14选择性地降低阳离子的通透性，特别是对Na+、K+、H+和NH4+的通透性［12-13］，而Claudin-2和-15则增加阳离子的通透性［14］。

Claudin-2主要表达于近端小管，也被报道在PECs中表达［15］，对于近端小管中有效的Na+和水的重吸收以及血压调节至关重要。Claudin-2介导的水转运占近端小管重吸收总水量的23%~30%［16］。claudin-2基因敲除小鼠（gene knockout，KO）模型显示，小鼠近端小管S2段的Na+、Cl-和水的跨上皮净吸收明显减少［17］。与野生型相比，正常饮食喂养的基因敲除小鼠（Cldn2-/-）体内保持着正常的Na+稳态，但在静脉注射2%NaCl后Na+、Cl-的排泄量增加，这表明，在静息状态下，肾脏可以代偿Claudin-2介导的Na+转运的损失，但在应激状态下，这种能力是不足的［17］。Pei等［18］从维持肾脏能量效率方面探讨了Claudin-2的Na+转运作用，他们认为细胞旁路转运是上皮组织进化的一种策略，以最大限度地提高能量效率，近端小管中细胞旁路盐重吸收的减少可能导致下游小管跨细胞盐重吸收的增加，氧消耗增加，这种额外的能量消耗会在缺血情况下引起肾小管损伤。除了Claudin-2，近端小管还可以表达Claudin-17，介导近端小管末段中Cl-的转运，在该节段Cl-的重吸收主要是由其浓度梯度驱动，经细胞旁路转运［19］。

髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）通过跨细胞途径主动转运Na+和Cl-，经细胞旁路选择性重吸收Mg2+和Ca2+，可见Claudin-3、-10、-11、-14、-16和-19表达。Claudin-10b、-14、-16、-19主要负责阳离子的转运和选择，Claudin-3则发挥屏障作用［20］。离体灌流Claudin-16-KO小鼠的TAL，TJ对包括Ca2+和Mg2+在内的二价阳离子选择性严重受损［21］。Claudin-16和Claudin-19在极化上皮细胞中的共表达可赋予TJ显著的阳离子选择性［22］。基因突变导致Claudin-16和Claudin-19功能丧失是家族性低镁血症伴高钙尿症和肾钙质沉着症（FHHNC）的病因［23］。更为重要的是，Claudin-16和Claudin-19相互物理性作用，TJ中失去其中一个会导致另一个被内吞［24］。

Claudin-4和-8是参与构成Cl-细胞旁路的主要TJ蛋白。Claudin-4-KO小鼠显示，尿液NaCl排泄显著增加，动物出现了低氯血症和低血压，这与全身细胞外液体量的减少一致［25］。Claudin-8-KO小鼠不仅在许多方面与Claudin-4-KO小鼠相似，比如盐和液体量的肾丢失，还出现了更严重的低血压［26］。这可能与这两个分子之间的相互作用有关，有研究证实它们其中一个的缺失会影响另一个在TJ的定位［27］。Claudin-7也在对醛固酮敏感的远端肾单位节段表达，但很难断定表达Claudin-7是否直接参与Cl-细胞旁路途径，因为在LLC-PK1细胞中过度表达和敲除表达claudin-7都会导致Cl-通透性降低［28］。

2.3 Claudins参与肾单位的发生发育 Claudin-1从肾单位发育的S小体期开始在PECs和肾小体内的足细胞中呈阳性表达，却仅在成熟PECs中持续存在［7］。足细胞紧贴于肾小球毛细血管的外表面，其次级突起间的裂孔膜（SD）参与构成滤过屏障，是形成原尿的重要结构。在肾单位发育的逗号小体和S小体期，足细胞可能借顶端的TJ相连；随后进入毛细血管襻期，足细胞开始建立其特征性的复杂结构，细胞连接处重新定位，TJ转变为SD。尽管二者转化的机制尚不完全清楚，形态也截然不同，但SD和TJ对于离子的高度选择性滤过却极为相似［29］，它们都参与了对顶底极化、细胞生长、分化和去分化的调控［30］。Gong等［31］使用claudin-1转基因小鼠模型，在成熟足细胞中诱导claudin-1基因的表达，引发严重的蛋白尿；通过冷冻蚀刻电子显微镜技术，发现SD向TJ转变的超微结构变化，证实Claudins和TJ在足细胞病理生理中具有重要作用，Claudins与SD组分的相互作用可能促进SD向TJ转变，并提出SD和TJ在发育和病理条件下可以互换的新概念。

3 Claudins与肾脏疾病

3.1 Claudin-10b与HELIX综合征 人claudin-10基因位于染色体13q31-q34上，包含5个外显子。在第1外显子中有2个claudin-10剪接变异体，编码2个主要Claudin-10亚型Claudin-10a和Claudin-10b［32］。2017年，三个独立的研究小组描述了claudin-10基因双等位基因突变的临床表现，首字母缩略词HELIX（多汗症、电解质紊乱、泪液过少、鱼鳞病、口干症）被用来命名这种综合征［32-34］。所有的HELIX综合征患者都有汗腺、唾液腺和泪腺的功能缺陷；大多数患者有血电解质异常、高镁血症和（或）低钾血症；25%的患者有3期慢性肾病，无肾钙质沉着症。TAL中claudin-10b缺失的小鼠表现出明显的高镁血症，尿液中Mg2+的排泄分数较低，轻度高磷血症，轻度多尿，饮水不足时无法浓缩尿液，K+排泄分数升高和髓质肾钙质沉着症，同时肾小球滤过率无明显受损［35］。而敲除claudin-10b会导致髓质TAL和肾钙化病中Claudin-16和Claudin-19复合物的表达增加，即除多尿和K+排泄分数升高之外，claudin-10b缺失引发的大多数症状可以通过同时敲除claudin-16得到纠正［36］。基因敲除实验结果显示，Claudin-10b特异性增加细胞旁路对Na+的通透性。实际上，TAL、汗腺和唾液腺中Na+的细胞旁路通透性较低可能是claudin-10b突变功能丧失的主要临床后果。在肾髓质TAL中，50%的Na+经细胞旁路被动地重吸收，Na+的细胞旁路通透性下降会影响Na+的重吸收，导致Na+的肾丢失，细胞外液体耗竭，继发性醛固酮增多和K+的肾丢失；较高的跨上皮电压会提高Mg2+和Ca2+在TAL的细胞旁路重吸收［36-37］。在唾液腺和汗腺导管中，Cl-经跨细胞途径分泌，Na+沿细胞旁路途径被动分泌，Claudin-10b功能缺失突变可减少Na+的分泌以及唾液和汗液的形成［20］。

3.2 Claudin-16和Claudin-19与FHHNC 人类claudin-16基因位于染色体3q27上，包含5个外显子。人类claudin-19基因位于染色体1p34.2上，也包含5个外显子。家族性低镁血症伴高钙尿症和肾钙质沉着症（FHHNC）是一种由claudin-16和claudin-19基因变异引起的常染色体隐性遗传疾病，其特征是尿中钙和镁的大量流失，导致低镁血症和高钙尿［23］。患者有肾钙质沉着症（肾实质内钙基晶体沉积）和肾功能衰竭，可能在其生命早期就发展为终末期肾病［23］。值得注意的是，低镁血症也可以不出现［38］。此外，患者也可能患有反复尿路感染、多尿、多饮和肾结石。

Claudin-16和Claudin-19只表达在TAL，对于Ca2+和Mg2+在TAL的细胞旁路转运起关键作用［39］。TAL能够重吸收肾小管腔内液体中25%~40%的Na+、50%~60%的Mg2+和30%~35%的Ca2+［40］，这种重吸收由跨上皮盐浓度梯度产生的管腔正电压驱动［22］。Claudin-16在低阻力的LLC-PK1细胞中独立表达时可以使细胞旁Na+通透性大幅增加，Mg2+的通透性适度增加，进而使选择性从阴离子选择性转变为轻微的阳离子选择性；Claudin-19在该细胞系中的表达也消除了阴离子选择性，但在这种情况下是通过降低Cl-的通透性来实现的；Claudin-16和Claudin-19的共同表达导致Na+和Cl-通透性的变化比它们各自单独表达的水平更为显著，因此表明这两种Claudins之间存在功能协同作用［22］。利用蔗糖梯度沉淀和化学交联反应，Gong等［22］从转染的HEK293细胞和Sf9细胞中分离出稳定的由Claudin-16和Claudin-19组成的二聚体。当将突变引入Claudin-16和Claudin-19二聚体的任一Claudin中时，所产生的TJ明显丧失其阳离子通透性，表明Claudins相互作用在FHHNC发病中的作用机制［21］。与此假设相符，在转基因动物模型中，claudin-16的缺失可导致Claudin-19从TJ处脱位，反之亦然［41］。采用RNA干扰技术分别建立了claudin-16-KO、claudin-19-KO小鼠模型则表现出与FHHNC相似的表型，即低镁血症和尿钙排泄增加，但没有肾钙质沉着和明显的肾功能不全［41］。在体外微灌注claudin-16-KO小鼠的TAL，可见Mg2+和Ca2+通透性显著降低，但阳离子选择性没有改变，且由于小鼠血压降低，血浆醛固酮浓度升高，NaCl的吸收可能因此受到损害［42］。Claudin-19-KO小鼠的肾脏异常和电解质失衡尚无进一步报道。由于Claudin-16和Claudin-19之间的相互作用，预期Claudin-19也会在claudin-16-KO小鼠的TAL中表达缺失，但Claudin-19的表达不受影响［21］。

3.3 Claudin-14与高钙尿性肾结石 人类claudin-14基因位于染色体21q22.3上，编码由239个氨基酸组成的蛋白质Claudin-14。在肾脏遗传性疾病中，并未发现claudin-14基因的变异体。然而，全基因组关联研究证实claudin-14是高钙尿性肾结石（hypercalciuric nephrolithiasis）发病的主要危险基因［43］。根据全基因组标准，claudin-14基因位点上的同义突变与肾结石风险增加和骨密度降低相关。常见的同义变异rs219780（C）纯合子患者肾结石的发病风险预计是非携带者的1.64倍；rs219780（C）变异也与尿Ca2+升高、血清甲状旁腺激素和血清总CO2减少显著相关，但与血清Ca2+水平无关［44］。claudin-14编码突变的患者可伴有耳聋，这种表型能在claudin-14缺失小鼠中被复制［45］。

原尿中20%~25%的Ca2+在TAL通过Claudins-16和-19组成的细胞旁路被重吸收［46］。Claudin-14主要表达在TAL，可能作为TAL中二价阳离子通透阻滞剂而发挥作用［21］。Claudin-14在各种细胞系中的过表达可降低Na+/Cl-的通透比率以及对Ca2+的通透性，如在转染的LLC-PK1细胞中，Claudin-14通过物理作用，可降低Claudin-16的胞外阳离子通透性［47］。另一方面，高钙饮食可提高Claudin-14表达，其调节高度依赖于Ca2+敏感受体（Ca2+-sensing receptor，CaSR）活性的改变。实际上，任何血清Ca2+浓度的升高或使用拟钙剂改变CaSR敏感性，都会大大增加Claudin-14的表达［48］。高钙血症引起的Claudin-14的表达增加可能会阻止Ca2+的细胞旁路通透，从而增加Ca2+的尿液排泄，以稳定血清Ca2+水平［49］。

4 小结

在不断的研究和探索中，人们对肾脏中的Claudins的结构、表达及其在肾脏生理、病理中的作用已有了较深入的认识。但仍有较多的问题亟待解决，如对Claudins功能和表达的调控机制仍不明确，而对于调控机制的新发现有可能为离子代谢疾病的治疗提供新思路。此外，Claudins在肾脏肿瘤中的作用还有待进一步探讨。