胡华杰 郭燕娜 周国儿# 张雷芳

1 舟山市中医院 浙江 舟山 316000

2 浙江海洋大学 浙江 舟山 316000

长期以来，浙贝母植株都是以鳞茎入药，其花和地上部分常常被作为废物丢弃[1]。近年来，研究陆续发现浙贝母花除含有与其鳞茎中相似的生物活性物质如生物碱和皂苷外，还含有黄酮类、脂肪酸、氨基酸等成分，具有抗炎、镇痛等作用[2-4]。此外，体外实验还发现其具有潜在的抗氧化和抗自由基作用[5]，具有广阔的资源利用空间。如果对这些废弃的浙贝母花资源进行开发利用，不仅可以有效提高浙贝母的利用率，而且能大大增加种植浙贝母的农业收益，提高人们的种植积极性，对于传统中药开发和发展也具有借鉴意义。

本研究以浙贝母花乙醇提取物为研究对象，初步探讨其体内抗氧化作用，为浙贝母花的临床应用提供理论依据，也为后期深入研究浙贝母花抗氧化作用的有效成分奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器：水流抽气机A-1000S、旋转蒸发仪N-1100均购自上海爱朗仪器有限公司；紫外可见分光光度计UV-1600购自上海美谱达仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱DGG-9240 A购自上海森信实验仪器有限公司；落地式超纯水机UPT-II-60L购自上海四科仪器设备有限公司；电磁炉C21-RH2014购自美的电器集团有限公司；涡旋振荡器Votlex-genie 2购自上海革冉仪器设备有限公司。

1.2 试剂：浙贝母花采自浙江省舟山市金塘镇，经鉴定为百合科贝母属植物浙贝母（Fritillariae thunbergii Miq.）的花；维生素C（批号：ST1434）、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；硫酸亚铁、葡萄糖、氯化钠、无水乙醇、碳酸钙均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 浙贝母花乙醇提取物的制备：称取自然干燥后粉碎的浙贝母花100g，加800mL 70%乙醇超声波提取3次，每次3h，抽滤，合并滤液，在减压条件下回收乙醇，烘干，即为浙贝母花乙醇提取物。

2.2 DPPH自由基清除率的测定：称取4.0mg的DPPH，加无水乙醇溶解，置100mL棕色容量瓶中，制备得到浓度为0.08mol/L的DPPH溶液，避光保存备用。分别吸取不同浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，单位：mg/mL)的样品溶液2.0mL到10mL的离心管中，再分别加入3.0mLDPPH溶液，在室温、避光条件下反应30min，蒸馏水为空白对照组，于517nm波长处分别测定它们的吸光值，计算DPPH自由基清除率，公式如下。实验重复3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=［A0-(AS-AC)］/A0×100%

A0：2.0mL蒸馏水+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AS：2.0mL样品溶液+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AC：2.0mL样品溶液+3.0mL蒸馏水的吸光度值

2.3 动物分组及给药：ICR小鼠50只，雄性，体质量28～30g(杭州子源实验动物科技有限公司，合格证编号：20210412Abzz0105999541)，在标准环境条件下(24±2℃温度、75%湿度和12h光-暗循环)饲养一周，自由进食、饮水。将小鼠随机分为正常组、阳性对照（VC）组和浙贝母花乙醇提取物高剂量组（0.8g/kg）、中剂量组（0.4g/kg）及低剂量组（0.2g/kg），每组10只。将浙贝母花乙醇提取物的干浸膏用少量0.5%CMC-Na溶解后，加入去离子水配成悬浮液进行灌胃给药，1次/d。阳性组使用0.03g/kg的维生素C进行灌胃，正常组使用等体积的0.5%CMC-Na水溶液灌胃，连续给药14d。

2.4 血清及肝、脑组织匀浆的制备：实验最后一次给药24h之后，眼球取血，3500rpm离心15min，分离得上层血清用于进一步分析。快速将小鼠处死并解剖，剥离得到肝脏以及脑组织，使用预冷的生理盐水对肝脏及脑组织冲洗数次，放置于白色操作台上拍照取证，再用其制成浓度为10%的组织匀浆，3500rpm离心10min，分离得上层血清用于进一步分析。

2.5 抗氧化指标的测定：按照相应的试剂盒说明书测定小鼠血清、脑组织、肝组织匀浆中的T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量。

2.6 统计学处理：实验结果用SPSS 22.0软件进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，各组数据均以（±s）表示，当P＜0.05时，具有统计学意义。

2.7 体外DPPH自由基的清除率：由图1可知，浙贝母花乙醇提取物对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加，两者呈正比关系。当浓度为0.8mg/mL时，清除率超过50%。当浓度为1.0mg/mL时清除率达到了59.28%。结果表明，浙贝母花乙醇提取物具有较好的体外自由基清除力，并具有潜在的体内抗氧化活性。

图1 不同浓度浙贝母花乙醇提取物对DPPH自由基的清除率

2.8 浙贝母花乙醇提取物对小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX影响：由图2可知，浙贝母花的乙醇提取物可以显著提高小鼠血清中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高剂量组改善最为明显（P＜0.05）。

图2 浙贝母花乙醇提取物对小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影响

2.9 浙贝母花乙醇提取物对小鼠脑组织中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX的影响：由图3可知，浙贝母花乙醇提取物能够提高小鼠脑组织中的T-SOD、CAT和GSH-PX的活性，降低MDA的水平，且中、高剂量组的改善更明显（P＜0.05）。

图3 浙贝母花乙醇提取物对小鼠脑中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影响

2.10 浙贝母花乙醇提取物对小鼠肝组织中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX活性水平的影响：由图4可知，浙贝母花的乙醇提取物可以提高小鼠肝组织中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高剂量组改善更明显（P＜0.05）。

图4 浙贝母花乙醇提取物对小鼠肝脏中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影响

3 讨论

正常情况下，机体内自由基处于一个动态平衡状态，但如果自由基产生过快或清除过慢，就会对机体造成伤害，甚至会诱发诸多疾病，例如癌症、类风湿性关节炎、心血管疾病、糖尿病以及与衰老相关的退行性过程[6-10]。抗氧化剂能够有效地清除自由基，使机体免受自由基的损伤，受到广泛应用。目前所使用的抗氧化剂多是人工合成，摄入过多会产生毒副作用，存在安全隐患[11]。天然抗氧化剂由于对机体的安全性高、无副作用且自身抗氧化能力强等特点愈来愈受到重视[12]，因此从植物中研究提取天然抗氧化剂具有重要意义。

DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的π-π共轭作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。

本实验中我们利用超声提取法制备浙贝母花乙醇提取物，测定了DPPH自由基的清除率，通过体内实验对其抗氧化作用进行了初步研究。实验结果显示，浙贝母花乙醇提取物具有较好的体外自由基清除力，中、高剂量组能够降低小鼠血清、肝脏和脑组织中的MDA含量，升高SOD、CAT、GSH-PX的含量，具有较好的体内抗氧化活性。下一步，课题组拟对浙贝母花乙醇提取物抗氧化的作用机制和其他提取物的抗氧化作用进行研究，为浙贝母花的进一步开发利用提供可行性基础。