颜达 王暖 王浩坤 杨丽娟 刘成霞

1滨州医学院附属医院消化内科，滨州 256600；2滨州医学院附属医院肿瘤研究实验室，滨州 256600

蛋白质的泛素化过程主要涉及3 种泛素化酶，分别是E1 泛素激活酶、E2 泛素结合酶和E3 泛素连接酶。人体内有600 多种E3，但只有2 种E1 和约40 种E2，因此目前认为E3 决定泛素化底物的特异性，被视为多种生理和病理进程中的关键［1］。

MARCH（membrane-associated RING-CH fingerprotein）家族起源及结构

MARCH 家族属E3 泛素连接酶家族，由MARCH1～11 组成。该家族成员具有保守且显著的结构特征，即从N-到C-端，存在1个环指结构域（RING-CH）及数量不等的（0～14 个）跨膜结构域（TM）。MARCH 家族共享的RING（Really Interesting New Gene）结构，分子量约为8 kDa，包含特征性间隔的半胱氨酸及组氨酸残基，以交叉支撑的方式结合两个锌离子。其中RING 结构域是MARCH 家族拥有E3 泛素连接酶活性的关键结构，而跨膜结构域负责底物特异性识别［2］。

两种主要的E3 泛素连接酶均分别包含HECT（homologous to E6AP C terminus）结构域或者RING 结构域。而RING结构域属于锌指模体类，拥有保守的半胱氨酸和组氨酸特异序列，因而据此分为RING-finger（C3HC4）、RING-H2-finger （C3H2C3） 、 LIM-finger （C2HC5） 和TRIAD-finger（C6HC）4 种类型。植物同源结构域（plant homeodomain，PHD）或者白血病相关蛋白结构域（leukemia-associated protein domain，LAP）结构层次上与RING-finger 相关，其结构序列特征是C4HC3。在γ-2 疱疹病毒和痘病毒以及小部分真核基因组中，发现了PHD/LAP结构域的亚家族，并命名为BKS结构域。酵母菌中SSM4或者DOA10蛋白含有该模体，SSM4负责蛋白酶体对疏水蛋白一个亚类的内质网（endoplasmic reticulum，ER）进行降解。细胞实验证明，该蛋白的BKS 结构域进一步作为泛素化连接酶发挥作用。由于在序列及功能上与RING 和RING-H2 结构域有相似性，所以它被提议命名为PHD/LAP模 体的BKS 亚 型，即RING-CH［3］。RING 结构 域最 早 由Freemont发现并报道，Freemont将其研究重点放在了一种富含半胱氨酸的序列，因为该序列被认为在那些与DNA 相互作用的蛋白中较为常见，所以含有该结构的蛋白或许拥有与DNA相互作用蛋白类似的功能［4-5］。

在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）基因组中的两种RING-CH 蛋白K3 和K5，和γ-2 疱疹病毒68（MHV68）的单个K3 基因，其蛋白翻译产物可以抑制细胞表面MHC-I 表达。此外，MHC-Ⅰ、KSHV-K5被发现能够下调细胞表面共刺激分子ICAM-1 和B7.2 表达。并且黏液瘤病毒同系物M153R 通过与疱疹病毒蛋白相似的机制，作用于MHC-Ⅰ和CD4。因此，γ-2疱疹病毒和痘病毒属共享同一个免疫逃逸蛋白家族，随后该家族被命名为免疫识别调节因子（modulators of immune recognition，MIR）、Scrapins 或 者K3家族［3］。

由于痘病毒属和疱疹病毒是不相关的病毒家族，因此病毒RING-CH 蛋白可能起源于真核宿主。目前已经存在几个疱疹病毒和痘病毒之间共享宿主相关免疫逃逸基因的例子。此外，在完成KSV基因组对应区域序列后，有研究发现在低等真核生物基因组中存在KSHV-K3 和K5 的基因同源物等［6］。随后几名研究人员更进一步描述了与病毒K3 家族相关的哺乳动物K3 相关基因。这些同源物之一被命名为c-MIR，并且发现具有和KSHV-K5 非常相似的方式下调B7.2 的作用。与病毒K3 家族形成对比的是，c-MIR 不能减少MHC-I的表面表达。包括c-MIR 在内还发现了8种其他与病毒蛋白相关的RING-CH 蛋白，随后该家族被命名为MARCH［3］。

MARCH2的发现及结构

编码人类MARCH2 蛋白的基因由Bartee 课题组在2004年发现，并确定其定位于人类第19号染色体短臂13区2 带（19p13.2），基因全长25 746 bp，其开放读码框编码246 个氨基酸，相对分子质量为2.6×104。并简单描述了MRCH2 的结构及分布，MARCH2 是二次跨膜蛋白，由1 个N-端RING结构域、2个二次跨膜区、2个双亮氨酸模体（LL）和1 个C-端的PDZ 结合结构域构成［3，7］，其中PDZ 结合模体对于MARCH2在细胞中的定位发挥着重要作用［8］。

MARCH2表达、定位及主要功能

MARCH2 广泛表达于人体各组织，亚细胞定位包括核内体膜、溶酶体膜以及内质网膜及质膜［3，8］，但根据UniProt数据库检索结果，MARCH2 在细胞膜上并没有分布。目前其已知的MARCH2蛋白靶点有囊性纤维跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、STX-6、DLG1、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、CD86（B7-2）以及β2-AR 等［9-10］。其主要作用包括：（1）可介导TfR 和CD86 的泛素化，并促进其随后的内吞作用和通过多泡体分选到溶酶体；（2）接受来自E2 泛素结合酶的泛素，然后将泛素直接转移到目标底物上；（3）可能通过与STX-6的相互作用参与核内体运输［8，11-12］。

1、MARCH2与CFTR

CFTR 是一种上皮细胞中的离子通道蛋白，在调节上皮细胞中水和离子的运输以及体液稳态中发挥重要作用［13］，还介导跨细胞膜的氯离子运输［14］；在气管中有助于调节气道表面流体层的pH 值和离子含量，从而发挥防御病原体的作用［15］；还可调节其他离子通道和转运蛋白的活性［16］。因此当CFTR 缺失时，会出现一系列病理状况，例如囊性纤维化［9］。夏丹等［17］的研究首次证实了MARCH2能够通过促进CFTR 泛素化修饰及降解从而调控细胞自噬。在通过RINAi 技术抑制MARCH2 表达水平后，发现肿瘤细胞自噬效应增强，并产生了肿瘤细胞生长阻滞。

在Cheng 和Guggino［9］的研究中，MARCH2 能诱导CFTR在溶酶体中的降解，该效应与CFTR 相关配体（CAL）及STX-6有关。

Xia 等［18］后 续 研 究 发 现，在 结 直 肠 癌 细 胞 中MARCH2 可以通过促进CFTR 泛素化及降解，从而发挥对肿瘤细胞自噬的调节作用。并通过该研究首次证实了MARCH2可以在结直肠癌细胞中负向抑制基础或应激诱导的细胞自噬。他们进一步的研究发现MARCH2对结直肠癌细胞自噬的调控，是通过PIK3CA-AKT-MTOR 信号通路实现的。并且揭示了在MARCH2 和CFTR 的反应中，MARCH2 中的功能性PDZ 结合结构域是不可或缺的部分。但该结论与Cheng 和Guggino［9］的研究结论相反，他们的实验中发现缺乏PDZ 结合结构域的MARCH2 依然可以有效促进CFTR 的泛素化和降解，因此认为MARCH2 的PDZ 结合结构域对于CFTR降解是非必需的。

2、MARCH2和STX-6

细胞囊泡之间对接和融合的调控由可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide - sensitive factor attachment protein receptors，SNAREs）介导，需要转运囊泡和目标囊泡膜表面的同源SNAREs 形成复合体，将两个膜并置在一起，膜融合过程才能发生。STX-6是一种广泛表达的SNAREs，定位在反式高尔基体网与核内体，在体内STX-6需要形成SNAREs复合体才能发挥作用，但该复合体的形成还需要STX 结合蛋白即MARCH2的参与［3］。

MARCH2 过表达可以导致STX-6 的重新分布［2，8］，并且MARCH2通过与STX-6结合作为核内体和反式高尔基体网络之间的运输调节因子［8］。在Nakamura 等［8］的研究中，发现MARCH2 在大鼠组织中广泛表达，并且发现其亚细胞定位于核内体膜和质膜。通过免疫共沉淀和体外结合实验表明，MARCH2 和STX-6 的C-端直接进行了特异性结合。在对MARCH2过表达后，观察到：STX-6以及与STX-6相互作用的SNAREs 重新分布到了MARCH2 阳性的囊泡中；影响了TGN38 和成对碱性氨基酸蛋白嵌合体到TGN 的运输，但不影响内吞降解途径与生物合成分泌途径（与STX-6 跨膜区缺失突变产生的结果类似）；显著降低了细胞表面转铁蛋白（transferrin，Tf）的表达，影响了Tf 的摄取，干扰了Tf 到细胞核周围循环内体的运输过程。在通过RNAi 技术敲低MARCH2后，发现TGN38/46和STX-6在TGN上的定位受到了干扰。这些现象表明，MARCH2 可能作为核内体与TGN之间的运输调节因子［8］。该研究虽然证明MARCH2参与了核内体与高尔基体网络之间的囊泡运输，但是无法回答MARCH2 是否参与内质网到高尔基体网络之间分泌蛋白运输。

3、MARCH2和DLG1

DLG1属于膜相关鸟苷酸激酶的分子支架蛋白家族，是正常发育所需要的多结构域支架蛋白，含有多个PDZ 结构域，可以将通道、受体及信号分子募集到极化细胞的离散细胞膜区域，还可能在黏附连接组装、信号转导、细胞增殖、分化、迁徙、细胞结构可塑性、突触发生和淋巴细胞活化中发挥作用［19-27］。据报道，含有PDZ 结构的分子支架在组织突触连接中发挥着核心作用，分子支架的泛素化以及核内体运输对于细胞-细胞连接与细胞极性的发生、维持具有重要意义［28］。

在Cao 等［28］的研究中，证明了DLG1 在表皮细胞中和MARCH2 共定于在细胞间接触部位的锚点，并且MARCH2 能以一种PDZ 结构域依赖的方式促进DLG1 的泛素化。当MARCH2 中的PDZ 结合模体缺失或者突变后，DLG1 与MARCH2 的共定位关系随之消失，并且MARCH2 的分布发生极化。这些发现表明MARCH2 可能作为具有泛素连接酶催化活性的分子桥梁，联系着内吞肿瘤抑制因子蛋白（例如STX）与支架蛋白的PDZ 结构域极性的确定。MARCH2中的PDZ配体模体参与了PDZ结构域蛋白DLG1 的识别和结合过程。但是MARCH2 是否被其他PDZ 结构域蛋白例如NHERF1 和NHERF2 募集仍处于未知［29］。

Xia［30］研究发现，在人类食管癌中，MARCH2和DLG1的表达呈负相关，并且MARCH2 表达增加更多出现在直径更大、不良分化、浸润更深、有淋巴结转移和更高TNM 分期的组织中。同时DLG1 的表达趋势则恰好相反。说明MARCH2 的高表达及DLG1 的低表达共同参与了食管癌的发生与进展。

4、MARCH2和TfR

TfR 主要功能是以非铁依赖性方式介导转铁蛋白结合铁的细胞摄取，还参与铁代谢、肝细胞功能和红细胞分化，具有两种亚型：TfR1 和TfR2［31］。MARCH2 能够降低TfR 在细胞表面的表达最初由Bartee 等［3］发现。有研究表明，MARCH2 过表达后能干扰TfR 在细胞表面的表达［7］。在COS7 细胞中，大部分细胞内的TfR 在MARCH2 过表达后重新定位到了MARCH2 阳性的囊泡中，并且MARCH2 过表达可以显著降低细胞表面的TfR。TfR 在细胞内的转运是通过受体介导的内吞作用从而被目的细胞吸收，然后通过早期/循环核内体返回细胞表面。并且证明了MARCH2 过表达可以阻碍TfR 到循环核内体的转运。与此同时，研究人员还观测到Tf 摄取下降，并且排除了Tf 摄取减少是因为MARCH2 本身对内吞途径抑制导致，因此Tf 摄取抑制很可能是因为TfR在细胞表面降低的直接结果。

5、MARCH2与CD86

CD86是抗原提呈细胞（antigen-presentingcells，APC）表面的一种共刺激分子，CD86 与T 细胞表面的共刺激分子CD28 结合，从而为T 细胞提供共刺激信号并使得T 细胞易于激活［32］。CD86 主要表达于活化的B 淋巴细胞和单核细胞，通过结合CD28 或者细胞毒性T 淋巴细胞蛋白（cytotoxic T-lymphocyte protein 4，CTLA-4），参与T淋巴细胞增殖和白细胞介素-2 的产生；还参与调节B 细胞功能，起调节IgG 水平的作用。研究发现，CD86 的泛素化是调节树突状细胞（dendritic cells，DCs）抗原提呈的关键机制［33］。

在Baravalle 等［33］研 究 中，发 现MARCH1 可 以 促 进CD86 的泛素化，并且这种泛素化在CD86 的调节中起关键作用。在该研究中证实了MARCH1 通过促进CD86 的泛素化从而下调CD86在树突状细胞中的表达，同时发现了还有MARCH2 和MARCH8 也能促进树突状细胞中CD86 的泛素化。

6、MARCH2与β2-AR

在慢性心力衰竭中，β2-AR 被儿茶酚胺类刺激后产生一系列生理反应，包括心肌细胞凋亡和肥大。与之相对的是，β2-AR 阻断剂有益于慢性心力衰竭患者的生存收益。血管平滑肌中β2-AR 和α1-AR 与配体结合通过调节血管紧张度参与器官血流分配，从而保证了体内重要器官的血液供应。面对压力或者运动时，心肌细胞β2-AR 的激活介导了心率增快和心肌收缩力增强［34］。

泛素化对于β2-ARs 到溶酶体转运过程及降解是必须的，并且β2-AR 在溶酶体中的泛素化降解是针对持续性的激动剂刺激进行脱敏反应的主要机制［34-35］。该研究通过蛋白组学证明MARCH2 参与了卡维地洛激动后β2-ARs 的泛素化修饰及降解，并且激活的β2-AR 的早期内吞及内吞后溶酶体分选过程是依赖于MARCH2 实现的。针对MARCH2 的这一特性，可以此为基础开发新的针对慢性心力衰竭的治疗药物。

7、MARCH2和ERGIC3

除了上述靶点外，MARCH2 还可通过其他机制发挥其生理作用调节细胞活动。针对前文提到了MARCH2是否参与内质网与高尔基体间的分泌蛋白运输，Yoo 等［36］给出了回答。通过生物素标志法鉴定出了高尔基体中间区室蛋白3（ER-Golgi intermediate compartment protein 3，ERGIC3）作为MARCH2 的底物，并且阐明了MARCH2 调节内质网和高尔基体之间的分泌蛋白运输是通过促进ERGIC3 的泛素化和降解实现的。并且MARCH2 和ERGIC3 的相互作用依赖于ERGIC3中的第6位和第8位赖氨酸。实验过程中发现在敲除ERGIC3 后，α1-抗胰蛋白酶和结合珠蛋白的分泌受到了阻碍。并且MARCH2 的过表达也可以降低α1-抗胰蛋白酶和结合珠蛋白的分泌，与此同时具有抗泛素化能力的突变ERGIC3 可以部分抵抗敲低MARCH2 带来的影响。从而证明了MARCH2 同过催化ERGIC3 的泛素化和降解，参与了内质网到高尔基体之间的分泌蛋白的运输。

除此之外，MARCH2 还参与人类免疫缺陷病毒的抑制［37-38］，以及非洲蟾蜍头部的形成［39］，并且在太平洋牡蛎中参与脂多糖免疫反应的调节［40］。

讨 论

MARCH2 广泛表达于人体各组织，且主要定位于核内体、内质网、溶酶体等质膜。由于拥有E3 泛素连接酶活性，MARCH2 通过泛素化其底物，促进底物分选、运输及降解，从而达到调节细胞活动的目的。目前对MARCH2在细胞内的认知主要通过其PDZ结合模体与PDZ结合蛋白发生作用从而参与胞质的物质转运，继而调控多种细胞内活动，并且部分研究发现MARCH2和消化道肿瘤之间还存在一定的关联性。与此同时，根据对RING 结构域蛋白的研究结果，含有RING结构域的蛋白很有可能能够和DNA相互作用［5］，因此除以上提到的作用及效应外，MARCH2 还具有与DNA 相互作用的可能性，但目前尚未见报道。由于MARCH2 在结直肠癌和食管癌中均具有病理意义，因此可将MARCH2 作为靶点开发针对消化道肿瘤的新药物或新方案。