陈睿尧卢宇程静曹婧媛张钊王丽杨长亮阳光 孙艺*

1中部战区总医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉 430070)

2四川大学华西医院罕见病研究院(成都 610041)

耳聋是临床常见的感觉缺陷性疾病，据2012年原卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告》显示，2008～2010年我国先天性耳聋发生率分别为1.99‰、2.15‰和2.19‰，其中50～60%的新生聋儿是由遗传因素致聋[1]。遗传性耳聋分为综合征型耳聋和非综合征型耳聋，后者以耳聋为唯一症状，约占遗传性耳聋的70%[2]。根据遗传方式不同，遗传性耳聋可分为常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传，X连锁遗传，Y连锁遗传及线粒体遗传。

遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族、不同地区的人群中不全相同。根据流行病学调查，导致中国耳聋人群常见的致聋基因为GJB2、SLC26A4及12S rRNA基因，其中GJB2、SLC26A4为常染色体隐性遗传，线粒体12S rRNA为母系遗传[3,4]。

本研究拟对湖北481例感音神经性耳聋患者进行GJB2、SLC26A4及12SrRNA基因突变检测[5]，以了解湖北省三个常见耳聋致病基因突变诊断率及突变形式，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究共招募了来自于湖北省的武汉、黄石、黄冈、襄阳、鄂州、荆州、宜昌的特殊教育学校及聋儿康复中心的481例耳聋患者，所有患者及家属均签署知情同意书，进行详细的病史询问,纯音听阈测定和声导抗检查，全身体格检查，并抽取外周血液样本。

1.2 诊断标准

根据纯音听阈结果，以较好耳500Hz、1KHz、2KHz、4KHz平均听阈判断听力损失程度，根据世界卫生组织（WHO）《障碍、残疾和残废的国际分类》（1997）听力损失标准对患者进行听力损失程度分级：26-40dBHL为轻度耳聋，41-60dBHL为中度耳聋，61-80dBHL为重度耳聋，81dBHL以上为极重度耳聋。

1.3 DNA的提取

每位受检对象取200ul血样用于提取基因组DNA，采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取血液基因组DNA。步骤如下：在1.5 ml离心管中加入200ul血样，加入20ul QIAGEN蛋白酶和200ul缓冲液AL，充分混匀后转移至恒温混匀仪，56℃200 rpm放置10 min，添加200ul无水乙醇，震荡混匀。将1.5 ml离心管中的混合物全部转移至QIAamp吸附柱中（吸附柱放在2 ml收集管中），8000 rpm的转速下离心1分钟，弃掉收集管中的液体。在吸附柱中添加500ul缓冲液AW1，全速离心1分钟，弃掉收集管中的液体。在吸附柱中添加500ul缓冲液AW2，关闭盖子并以全速离心3分钟。将吸附柱转入1.5 ml离心管，室温静置5 min。在吸附柱内滴加200ul缓冲液AE，在室温（15-25℃）下静置1分钟，然后在8000 rpm的转速下离心1分钟，离心后所得液体即为基因组DNA。

1.4 GJB2、SLC26A4及12S rRNA基因突变检测

利用SNPscan技术对GJB2基因36个位点、SLC26A4基因77个位点、线粒体12S rRNA基因2个位点进行检测[6]。SNPscan技术利用连接酶连接反应的高特异性对检测变异等位基因进行识别，通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列，利用连接酶通过连接反应获得特定变异对应的不同长度连接产物，再利用标记不同荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过一代测序仪对扩增产物进行毛细管电泳分离，最后通过GeneMapper软件分析读取各个变异位点的基因型。

2 结果

481例患者中，年龄跨度1～74岁，其中男性253例，女性228例，其中汉族449例，占93.3%，少数民族包括土家族（30例）、回族（1例）、畲族（1例），共占6.7%；发病年龄：6岁前占93.8%（451/481），6岁后占6.2%（30/481）；轻度感音神经性聋占0.8%（4/481），中度感音神经性耳聋占7.7%（37/481），重度感音神经性耳聋占82.8%（398/481），极重度感音神经性聋8.7%（42/481）。481例患者中，共 165例（165/481,34.3%）检测出GJB2、SLC26A4及12S rRNA基因突变，其中18.9%（91/481）诊断为GJB2基因突变致聋，12.9%（62/481）诊断为SLC26A4基因突变致聋，2.5%（12/481）检测出12S rRNA基因突变。

2.1 GJB2基因诊断结果

481例患者中，有18.9%（91/481）的患者诊断为GJB2基因突变致聋，包括13个突变位点，分别为c.235delC、c.299_300delAT、c.176_191del、c.508_511dup、c.560_605dup、c.230G＞A、c.257C＞G、c.139G＞T、c.-23+1G＞A、c.35delG、c.427C＞T、c.95G＞A、c.9G＞A。

突变患者中47例为纯合突变，分别为45例c.235delC，1例c.299_300delAT，1例 c.176_191del，复合杂合突变44例（见表1）。

表1 GJB2基因检测结果Table 1 Patients with Bi-allelic Pathogenic Variants in GJB2 Gene

2.2 SLC26A4基因诊断结果

481例患者中，有12.9%（62/481）的患者诊断为SLC26A4基因突变致聋，包括25个突变位点，分别为c.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1229C＞T、c.2168A＞G、c.1174A＞T、c.1318A＞T、c.1547dup、c.1692dup、c.1707+5G＞A、c.1975G＞C、c.2162C＞T、c.589G＞A、c.754T＞C、c.1226G＞A、c.665G＞T、c.2027T＞A、c.2167C＞G，c.1546C＞G、c.1594del、c.1595G＞T、c.1586T＞G、c.281C＞T、c.1079C＞T、c.1336C＞T、c.1343C＞A。

突变患者中25例为纯合突变，分别为21例c.919-2A＞G，2例c.1229C＞T，2例c.2168A＞G，复合杂合突变37例（见表2）。

表2 SLC26A4基因检测结果Table 2 Patients with Bi-allelic Pathogenic Variants in SLC26A4 Gene

2.3 12S rRNA基因检测结果

481例患者中，有2.5%（12/481）患者检测为12S rRNA基因突变，均为m.1555A＞G基因突变。

2.4 少数民族患者基因检测结果

32例少数民族患者中，土家族30例，回族1例，畲族1例，土家族患者均来自湖北恩施土家族苗族自治州、五峰和长阳土家族自治县。32例患者中43.8%（14/32）明确了遗传病因，18.8%（6/32）的患者诊断为GJB2基因突变，检测出3个突变位点，3例c.235delC/c.235delC纯合突变，2例杂合突变，即c.235delC/c.299_300delAT和c.299_300delAT/c.560_605dup；21.9%（7/32）的患者诊断为SLC26A4基因突变，检测出3个突变位点，5例c.919-2A＞G/c.919-2A＞G纯合突变，2例杂合突变，即c.919-2A＞G/c.754T＞C和c.919-2A＞G/c.1547dup；3.1%（1/32）的患者检测出12S rRNA基因突变，突变位点均为m.1555A＞G（见表3）。

表3 少数民族患者GJB2，SLC26A4和12S rRNA基因检测结果Table 3 Minority Patients with Pathogenic Variants in GJB2，SLC26A4,and 12S rRNA Gene

3 讨论

本研究共招募湖北省481例耳聋患者进行常见耳聋基因GJB2、SLC26A4及12S rRNA的突变检测，共有165例（165/481,34.3%）明确了遗传病因，其中18.9%（91/481）诊断为GJB2基因突变致聋，12.9%（62/481）诊断为SLC26A4基因突变致聋，2.5%（12/481）检测出12S rRNA基因突变。轻度及中度聋患者占8.5%（41/481），其中3例患者诊断为GJB2基因突变，6例患者诊断为SLC26A4基因突变；重度及极重度聋患者占91.5%（440/481），其中88例患者诊断为GJB2基因突变，56例患者诊断为SLC26A4基因突变，12例患者检测为12S rRNA基因突变。因此在本研究耳聋患者中，轻度、中度、重度及极重度聋患者均可存在GJB2及SLC26A4耳聋基因突变，但以重度及极重度聋患者基因突变多见；而12S rRNA基因突变患者导致的耳聋均为重度或极重度聋。

GJB2基因突变是中国耳聋患者最常见的致聋原因，GJB2基因表达在内耳非感觉上皮细胞和组织连接细胞，在声音传导过程中，GJB2蛋白对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起到调控作用，GJB2基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受到影响，浓度改变，引起Corti器钾中毒，导致感音神经性聋。GJB2基因突变为常染色体隐性遗传。迄今为止，已发现GJB2基因突变位点超过300个[7]，常见的突变形式包括：c.35delG、c.235delC、c.176_191del等，其位点突变具有地域性，在欧美地区发生率较高的为c.35delG[8]，而在我国发生率较高的是c.235delC[9]。全国聋病分子流行病学调查显示21.01%的耳聋患者携带GJB2基因突变[10]，本研究中18.9%（91/481）的患者诊断为GJB2基因突变，检测出13个突变位点，其中c.235delC为GJB2基因主要突变位点，与国内多数地区报道一致，突变率为17.74%（85/481），次要突变位点为c.299_300delAT，突变率为4.4%（21/481）。GJB2基因纯合突变47例，占总样本9.8%（47/481），c.235delC纯合突变45例，占总样本9.4%（45/481）,杂合突变44例，占总样本9.1%（44/481），其中c.235delC/c.299_300delAT基因突变17例，居GJB2杂合突变患者数首位。GJB2基因突变通常表现为先天性重度或极重度感音神经性聋，极少数病例表现为轻度或中度感音神经性聋[11]，本研究中也仅有3例听力表型为轻度或中度感音神经性聋。

SLC26A4基因为中国耳聋患者第二大常见基因，它所编码的蛋白产物Pendrin是一种阴离子跨膜转运蛋白，主要调节内淋巴液的离子平衡。SLC26A4基因突变可影响内淋巴液离子环境的动态平衡，从而导致听力损失。患者出生时可听力正常，或伴有不同程度的听力损失，不易被父母察觉，多因头部外伤、倒立、感冒、用力擤鼻、咳嗽等诱发急性或者进行性听力下降。在我国，约有97.9%的前庭导水管扩大患者由SLC26A4基因突变致病[12]，而高加索人的比例大约为三分之二[13]。目前国际上已发现SLC26A4基因超过500个突变位点[14]，最常见为c.919-2A＞G[15]，本研究12.8%（62/481）的患者诊断为SLC26A4基因突变，检测出25个突变位点，其中c.919-2A＞G为主要突变位点，突变率为10%（48/481），次要突变位点为c.1229C＞T，突变率2.1%（10/481）。SLC26A4基因纯合突变25例，占总样本 5.2（25/481），其中 c.919-2A＞G纯合突变21例，占总样本的4.7%（21/481）,杂合突变37例，占总样本的7.7%（37/481），且杂合突变位点呈多样性分布，但以含c.919-2A＞G的杂合突变最多，占总样本5.6%（27/481），其次为含c.1229C＞T的杂合突变，占总样本的1.7%（8/481）。SLC26A4基因突变患者中，6例中度聋患者均为语前聋，且均无外伤、感冒、剧烈运动等病史，而有1例重度聋患者为语后聋，该患者在9岁时受到头部外伤后出现双侧重度感音神经性聋，提示我们在患者年幼时，可通过预防环境因素的影响，使SLC26A4基因突变患者保持较好的残余听力。

1993年Prezant[16]等发现线粒体12S rRNA基因的m.1555A＞G突变是引起氨基糖苷类药物导致耳聋的分子病理基础，之后m.1494C＞T突变被报道也与其有关[17]，国内多数地区报道m.1555A＞G突变阳性率为1%～3%[18]。本研究中2.5%（12/481）的患者检测出12S rRNA基因突变，均为m.1555A＞G基因突变位点，且均为重度或极重度感音神经性聋，与患者既往有氨基糖苷类药物使用有关。

本研究应用SNPscan技术对湖北省481例耳聋患者进行GJB2、SLC26A4及12SrRNA基因的115个位点进行突变检测，总体诊断率为34.3%，GJB2、SLC26A4和12S rRNA3个基因突变诊断率分别为18.9%、12.9%和2.5%。詹悦等[19]报道湖北地区306例 0～5.5岁的极重度耳聋患儿GJB2、GJB3、SLC26A4和12S rRNA4个耳聋基因的9个突变位点筛查结果，总体诊断率为43.14%，GJB2、SLC26A4和12S rRNA3个基因突变诊断率分别为29.41%、13.72%和0.65%。因本研究病例的年龄和耳聋的程度分布与之不完全相同，显示诊断率也不尽相同。本研究检测出39个突变位点，扩大了湖北地区耳聋患者的突变谱，32例少数民族患者检测出GJB2、SLC26A及12S rRNA基因7个突变位点均包含于汉族患者检测出的39个基因突变位点中，三个基因最常见突变形式与本地区汉族患者一致。32例少数民族耳聋患者SLC26A4基因突变比例较GJB2高，可能与本研究中少数民族患者样本较少有关，需进一步扩大样本研究。