倪晓琛 李佳楠 戢小军 罗意 陈伟 杨仕明

解放军总医院第六医学中心耳鼻咽喉头颈外科医学部(北京 100853)

国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心(北京 100853)

聋病教育部重点实验室(北京 100853)

聋病防治北京市重点实验室(北京 100853)

Waardenburg综合征（Waardenburg syndrome，WS）是一种以听觉-色素异常为特征的遗传性综合征性疾病，由丹麦医生于1951年首次报道，其遗传方式呈不完全显性遗传。WS在人群中的发病率为1/42000，约占遗传性耳聋患者的2-5%[1,2]。由于WS致病基因的多样性，其临床表现也具有明显异质性，在同一家系的不同个体之间可能呈现出不同的临床表型。其中，以虹膜色素异常，感音神经性聋，内眦异位以及前额白发为四大典型临床特征[3]。其中感音神经性聋是WS的常见临床特征，约9-62.5%的WS患者表现为感音神经性聋。同时感音神经性聋也是患者就医的主要原因，也是影响患者生活质量的主要症状。除此之外还包括面部雀斑，全身不同部位皮肤出现脱色素白斑等色素异常的相关临床表现。依据患者不同的临床表现，可以将WS分为 4型[4]。WS1（OMIM 193500）以及 WS3（OMIM 148820）均以PAX3突变为主，并以内眦异位为典型临床特征。同时非对称性听力损失，皮肤脱色素白斑，前额白发均多见于PAX3为致病基因的患者中[5]。WS1患者中，约47-53%的患者表现出感音神经性聋，约15-30%具有虹膜异色，约52-100%出现鼻根增宽，63-73%的患者表现出连眉[6]。3型的临床表现与1型相似，在1型的临床表现基础上还伴有四肢异常，如关节挛缩、上肢骨骼发育不全、并指、短指和手指挛缩。2型患者的致病基因复杂，目前仍有超50%的患者无法明确致病基因。依据不同的致病基因，进一步分为2A（OMIM 193510）、2B（OMIM 600193）、2C（OMIM 606662）、2D（OMIM 608890）、2E（OMIM 611584）五型。在明确致病基因的患者中，以MITF以及SOX10突变较为常见。二者之间的临床特征存在差异。在WS2中，新发突变、先天性内耳畸形多见于SOX10突变的患者，面部雀斑则为MITF突变患者的主要特征[5,7]。同时约87%的2型患者出现感音神经性聋[8]。WS4（OMIM 277580）以EDNRB、EDN3、SOX10突变为主要致病基因。其临床表现与2型相似，并伴有巨结肠[9,10]，较为罕见。目前关于WS发病机制的研究多认为与胚胎时期神经嵴细胞的发育不良有关。尽管不同基因之间致病机制相似，但是对神经嵴细胞迁移、分化的作用机制有所差异。本文拟对致病基因的分子机制进行综述，探讨相关临床表型差异的原因，并将深入讨论WS治疗以及预后。

1 WS致病机制

神经嵴细胞是在发育过程中短暂出现的胚胎细胞群，在原肠胚以及神经形成期间出现，随胚胎发育，可分化为颅面骨骼、交感神经、周围神经系统、肾上腺嗜铬细胞以及黑色素细胞。其分化迁移过程错综复杂，包括多种信号通路，如WNT,BMP,FGF,Notch；也涉及Zic1,PAX3/7,Gbx2等多种转录因子。这些转录因子表达于神经板边缘，启动、维持相关分化基因的表达，包括SOX8,SOX9,SOX10,FOXD3,SNAI1/2,cMyc[11]。WS则与黑色素细胞的迁移、分化异常密切相关。在哺乳动物中，黑色素细胞可以进一步分为两类，一类为KIT敏感的皮肤黑色素细胞，位于皮肤，参与表皮以及毛囊的色素形成过程；另外一类为KIT欠敏感的黑色素细胞，分布于全身各处，包括周围神经系统，心脏，眼以及内耳等[12]。在内耳中，黑色素细胞分化为耳蜗血管纹中的中间细胞，并通过表达钾通道蛋白KCNJ10分泌K+参与耳蜗内淋巴液电位的维持[13]。当基因突变影响黑色素细胞分化、迁移时，则可能对耳蜗内电位产生影响，导致感音神经性聋的出现。

2 常见致病基因分子机制

2.1 PAX3

PAX3（paired box gene 3）属于转录因子PAX家族中的一个亚型，具有高度保守的DNA配对区，由PAX3基因编码并具有特征性的N末端DNA结合区以及C末端的转录激活区。PAX3基因中包含10个外显子，编码蛋白具有4个结构阈，包括保守的配对结合区、八肽、同源结构域、富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸的羧基末端。PAX3通过与下游基因结合，调控下游基因表达水平，如SOX10；也可以通过其他信号转导通路，调节自身基因表达水平。PAX3基因表达在神经嵴的发育以及分化过程中有着重要的作用。神经诱导过程中，随着神经嵴细胞的出现、迁移、分化，PAX3在其分化而来的一系列细胞系中均有表达，包括黑色素细胞以及神经根细胞，施万细胞的祖细胞。并且PAX3的表达对黑色素细胞在内耳中的分化有着重要作用[14]，使其进一步分化为耳蜗血管纹中的成熟的中间细胞，参与内耳的动作电位的形成。WS1型的患者中约90%为PAX3基因杂合突变。目前已有报道超过100种PAX3的基因突变位点，并且少有重复。这些突变位点多位于PAX3基因的2至6号外显子，其中以2号外显子居多，并以错义突变较为多见[15]，导致PAX3的DNA配对结合区产生功能改变，影响与其他基因的配对结合，如SOX10，MITF。而在临床表现更为严重的WS3型的患者中多为PAX3基因或临近基因的部分缺失或全部缺失。在PAX3突变的患者中发现，当位于同源结构阈以及富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸的羧基末端的氨基酸缺失，更易出现皮肤色素的异常改变。而听力下降的发生概率未见明显差别[16]。

2.2 MITF

黑色素细胞诱导相关转录因子（Melanocyteinducing transcription factor，MITF）是一种转录因子编码基因，编码MITF蛋白。MITF是碱基-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（basic-helix-loop-helix-leucine zipper，bHLH-ZIP）家族中的一种转录因子，具有三个特征性的结构域，包括参与蛋白质二聚化的螺旋-环-螺旋、亮氨酸拉链结构域，以及DNA结合域。在转录过程中，不同的转录起始位点以及RNA的选择性剪切可以产生不同的MITF亚型。其中包括黑色素细胞特异性的MITF（MITF-M），心脏特异性的MITF（MITF-H）。不同的亚型存在于不同的组织以及器官中[17]。亚型之间组织表达特异性以及蛋白质二聚化异质性使MITF具有复杂的生物特性。MITF在体内具有极其复杂的生物活性，可以参与多种生物途径[18]。包括黑色素细胞的存活、增殖、分化、代谢以及黑色素的形成。MITF通过调节黑色素生成的相关基因酪氨酸酶（tyrosinase，TYR),酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase-related protein-1，TYRP1)，酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase-related protein-2，TYRP2)对黑色素的生成进行调节[19]。鉴于MITF在黑色素细胞的生物过程中的重要作用，其过表达以及低表达均可导致不同的疾病出现。在30%的黑色素瘤组织中存在MITF的过表达，可能与磷酸化导致的活性增强相关。当MITF功能不足时，则会导致一系列相关疾病，包 括 WS2，Tietz albinism-deafness syndrome(TADS 103500)。MITF突变占WS2患者中的20%，并以杂合突变为主，突变位点多位于编码bHLHZIP的7、8号外显子。可能导致了MITF蛋白质二聚化受阻，出现了单倍体剂量不足[17]。最终导致无法激活下游目标基因TYP，TYRP1以及DCT转录。在人类胎儿的耳蜗中，MITF仅在黑色素细胞上表达，因MITF突变导致的WS综合征可能与耳蜗内的黑色素细胞密切相关[20]。MITF的表达受到多种途径的调节。在MITF表达以及活化的过程中，主要的正向表达调节包括WNT/β-catenin、SOX10，并且MITF还可以通过LEF-1/β-catenin通路促进自身基因的表达[21]。在WS2型患者中，MITF的单倍体剂量不足可能通过WNT/β-catenin途径进行调节，一定程度上弥补剂量不足带来的临床表型[22]。MITF突变的患者中，听力下降的发生率约为89.6%[23]。并且患者中常表现出面部雀斑，在亚洲人群中，尤其显著[5,7]。

2.3 SOX10

SOX10属于SOX转录因子家族，包括SOX8、SOX9，以HMG(high mobility group)DNA结合域为特征，在决定细胞分化方向以及细胞分化过程中有重要调控作用[24]。在神经嵴细胞后期的发育分化过程中有着重要的调控作用，尤其黑色素细胞以及外周神经胶质细胞[24]。同时SOX10可以激活MITF表达以及调节酪氨酸酶相关蛋白2（TYP2/Dct）基因的表达进而对黑色素细胞分化进行调节。在早期耳蜗的发育过程中，SOX10不仅表达于耳蜗内黑色素细胞，同时也表达于耳蜗导管上皮以及外周胶质细胞，耳蜗螺旋神经节细胞。因而SOX10突变导致WS出现的相关听力损失可能与多种细胞相关[20,25]。鉴于与人类耳蜗结构、发育过程的相似性小型猪模型可以对疾病的研究提供良好的模型[26]。在SOX10错义突变的小型猪模型中进一步发现，SOX10突变与耳蜗分隔不全相关[27]。而在SOX10基因突变的WS患者中，同样发现多合并不同程度的内耳畸形，包括前庭扩大以及内耳分隔不全[28]。在人类疾病中，SOX10突变与多种疾病相关，WS2型、WS4型、外周神经脱髓鞘病变，先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease OMIM 142623）以及卡尔德曼综合征（Kallmann syndrome，KS）。同时已有报道，由SOX10突变导致的2型WS合并KS[29]。在多数可以导致疾病出现的SOX10突变中，均可导致提前终止密码子的出现，产生截短蛋白，经无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）或者截短蛋白的负性效应进而影响SOX10的相关功能[30]。当截短蛋白逃逸NMD途径，以突变蛋白的负性效应为致病机制时，则导致最为严重的疾病表型，PCWH综合症（OMIM 609136），表现为复杂的神经嵴病变，包括外周脱髓鞘病变，中枢性髓鞘形成，WS，先天性巨结肠[31]。

2.4 EDNRB/EDN3

内皮素信号系统是由两种G蛋白偶联跨膜受体以及3种配体组成，其中EDNRB和EDN3在黑色素细胞以及肠神经元发育中有着重要作用，尤其在黑色素细胞进一步定向分化为中间细胞的过程中，如细胞迁移，增殖，血管生成以及细胞骨架重组[32]。同时EDNRB在螺旋神经节上的表达，对于出生后听力的形成有着重要作用。在出生后19天Ednrb纯合突变的大鼠中，观察到耳蜗底转螺旋神经节的密度较野生型的大鼠的密度低20%-30%。并且出现螺旋神经节的衰退[33]。EDNRB/EDN3突变产生的相关效应与蛋白质剂量相关。EDNRB/EDN3纯合以及杂合突变均可导致4型Waardenburg综合征以及部分2型的出现[34]。EDNRB纯合突变（或可疑、证实的复合杂合突变）中，70%呈现为完全隐性遗传[1]。对于EDNRB/EDN3突变的患者而言，没有明显的基因与表型的关联。在纯合突变的患者中，携带突变基因的杂合个体可以呈现为无症状，或者疾病的部分表型。在WS中，EDNRB/EDN3突变致病的患者中，表现出听力损失的比例为53.3%、75%[23]。

3 治疗以及预后

目前针对听力损失的治疗方法主要为佩戴助听器以及人工耳蜗植入（Cochlear implantation,CI）。对于WS患者而言，目前的主要治疗方法同样为以上两种。助听器的佩戴需要满足一定听力条件；对于重度以及极重度听力损失患者而言，人工耳蜗植入是主要的治疗方法。CI通过直接刺激听神经，将听觉信号传导至大脑皮层，是目前治疗听力损失最佳的治疗方式。但是人工耳蜗术后康复效果却有很大差异，目前关于WS患者CI术后康复效果，尤其言语识别方面的效果结论不一，Amirsaiari S等[34]认为WS患者在行人工耳蜗植入后的1年，在听力学结果中与非综合征性聋的患者相比无显著差异，但是在言语识别中具有显著差异。而在Ba Kkourl[35]以及Cullen R[36]等的研究中，WS患者以及GJB2突变的患者均可获得较好的言语以及认知效果。

人工耳蜗术后康复效果受到多种因素的影响，耳蜗的植入时间、植入时患者的残余听力、患者有无合并内耳畸形、是否存在听神经病变、家庭训练、家庭经济情况等。其中螺旋神经节（spiral ganglion neuron,SGNs）的功能、数量[37]，致病基因也是重要影响因素[38,39]。

在先天性感音神经性聋的儿童中，有50%的患儿可以明确致病基因。不同的致病基因导致不同的病变出现，因而可能与耳蜗术后效果相关[40]。对于表达局限于内耳中的基因，常见的致病基因有：GJB2、SLC26A4、OTOF以及线粒体基因，均可获得较好的术后康复效果。而对于表达在SGNs、脑干听觉核团，如DFBNB59基因，PCDH15基因，则人工耳蜗植入术后效果不佳[38]。而对于综合征性聋的患者而言，术后康复效果较差[40]。

McClellan[41]等人通过术中耳蜗电图预测术后言语康复效果，进一步证实SGNs的功能与术后言语识别之间的重要联系。目前越来越多的研究证实在人工耳蜗植入中，SGNs发挥着重要作用。对于突变基因高表达于SGNs的感音神经性聋患者而言，术后康复效果不佳[42,43]。当突变基因倾向于表达在SGNs，可能与SGNs的衰退相关，并可能导致术后效果不佳[43]。Nishio等[44]比较了在大鼠耳蜗中不同细胞的特异性耳聋基因的表达水平，并发现Snai2基因主要表达于SGNs，Edn3，Pax3在SGNs中的表达水平高于耳蜗中的其他细胞，Mitf在SGNs中也有较高的表达。因而可以推测这些WS相关的致病基因在SGNs中的高表达可能会影响SGNs的相关功能。同时Ido-Eto等[33]已证实在Ednrb/Edn3突变的大鼠耳蜗中出现SGNs的衰退。Chen W等[45]在Mitf-M突变的荣昌猪中发现，在出生后30天SGNs开始出现衰退。考虑到动物模型中WS相关致病基因对SGNs的影响，我们可以由此推测在WS患者的言语康复效果不佳，可能与SGN功能以及数量相关。但是由于WS致病基因的不同，对SGNs的影响不一，故出现评价不一，可能是研究中未考虑致病基因。日后对于WS人工耳蜗术后的效果评价仍需进一步研究，尤其在评价其SGNs的数量以及功能状态方面需要进一步结合基因进行研究。

4 展望

尽管目前WS患者行人工耳蜗植入后可以实现重获听力，但是有部分患者由于螺旋神经节细胞的数量以及功能状态的限制，未能获得较好的术后康复效果。目前基因疗法以及干细胞疗法已经成为关于先天性感音神经性聋患者治疗研究的热点。对于明确致病基因的患者，基因疗法可以从根本解决患者听力损失的原因。基因编辑技术CRISPER/Cas9成功应用于转甲状腺素蛋白淀粉样变性的患者，1期临床试验取得突破性进展，为基因编辑技术逐步应用于遗传性疾病开拓了道路[45]。与此同时，CRISPER/Cas9已经成功应用于Mitf突变的小型猪模型中，可以有效改善突变型动物的听力[46]。尽管目前尚未进行进一步的临床研究，但是基因疗法终将进入临床，有望改变遗传性疾病进程，尤其遗传性聋患者。干细胞疗法通过诱导干细胞定向分化SGNs，可以弥补SGNs数量以及功能不足，结合人工耳蜗植入极大程度改善遗传性聋患者听力预后[47]。这两种疗法有望从根本解决遗传性聋的治疗难题，为听力损失患者带来希望。