陈超，李俊霖，朱朝庚

（1.永州市中心医院 肝胆外科，湖南 永州 425100；2.湖南中医药大学第一附属医院 肝胆外科，湖南长沙 410021）

胆囊癌作为胆囊上皮恶性肿瘤，约占全部胆道肿瘤的2/3，与其他消化道肿瘤相比，胆囊癌起病隐匿，但早期已通过淋巴结、血液扩散转移，危害严重[1]。多数胆囊癌患者在发现时已至晚期，因此尽早发现与胆囊癌有关的因子，对于治疗具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）作为过度保守的短链非编码RNA，在肿瘤中通过靶向目标基因的转录或翻译，进而调控癌症发展[2]。研究显示，miR-103a-3p在不同癌细胞中的作用不同，在前列腺癌中抑制癌症进展，而在结直肠癌中促进癌症进展[3-4]。目前有关miR-103a-3p在胆囊癌中的作用尚未见相关研究。SIX同源盒蛋白4（SIX homeobox 4，SIX4）的表达异常参与了肿瘤的发生、发展过程，增强多种类型肿瘤的增殖、侵袭和转移，同时SIX4亦是多种miRNA的靶基因[5-7]，但SIX4 在胆囊癌中的功能尚不清楚。本研究旨在了解胆囊癌组织中miR-103a-3p、SIX4的表达情况，观察过表达miR-103a-3p对胆囊癌细胞SIX4表达及癌细胞增殖、侵袭的影响，初步探讨其机制，以期为胆囊癌的靶向治疗提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

组织：胆囊癌组织及癌旁组织（距离癌组织＞2 cm）取自永州市中心医院2019 年10 月至2021 年9 月32 例接受手术治疗的胆囊癌患者，患者术前均未接受化疗等抗肿瘤治疗。从癌症体细胞突变目录（COSMIC）数据库（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）中下载胆囊癌组织样本数据，包括样本的基本信息和病理数据。

细胞：胆囊癌细胞系GBC-SD购自北纳生物（产品编号：BNCC341817）。

1.2 试剂与仪器

引物由上海生工生物工程科技有限公司合成；SIX4 野生型（wild type，WT）、SIX4 突变型（mutant，MUT）、mimic NC、miR-103a-3p mimic、Lipofectamine®2000 试剂盒、pc DNA3.1 质粒、pc DNA3.1-SIX4 质粒均购自广州锐博生物公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技有限公司（货号：C0037）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、一抗兔源SIX4、增殖细胞核相关抗原Ki-67、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）2、MMP9 以及内参GAPDH、二抗羊抗兔，均购自英国Abcam公司（货号分别为：ab228530、ab176713、ab16667、ab92552、ab92536、ab76003、ab9485、ab6721）。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪，美国Applied公司（型号：7500）；蛋白凝胶成像系统，上海天能科技有限公司（型号：Tanon 5200）；酶标仪，深圳汇松生物科技发展有限公司（型号：MB-530）。

1.3 实验方法

1.3.1 qRT-PCR检测组织中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平：胆囊癌组织以及对应癌旁组织分别取30 mg，冰上研磨充分，添加1 mL Trizol，提取组织中总RNA，分光光度计检测RNA浓度和纯度。RNA进行逆转录，qRT-PCR仪检测组织中SIX4、miR-103a-3p以及对应内参β-actin、U6。引物序列：SIX4 F：5’-TCTCGGGGTGATCGACAAGAA-3’，R：5’-CCC TTTGTTCATTCGTTCCTGG-3’；β-actin F：5’-CCTG GCACCCAGCACAAT-3’，R：5’-GCTGATCCACAT CTGCTGGAA-3’；miR-103a-3p F：5’-GAGCAGCAT TGTACAG-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应条件：95 ℃、75 s；95 ℃、30 s，60 ℃、40 s，45个循环。2-ΔΔCT法对SIX4、miR-103a-3p表达水平进行定量分析。

1.3.2 双荧光素酶鉴定miR-103a-3p与SIX4的靶向关系：TargetScan数据库查找SIX4 mRNA的3’UTR与miR-103a-3p的结合位点。设计合成SIX4的3’UTR WT和3’UTR MUT（SIX4 3’UTR-WT、SIX4 3’UTRMUT），分别与miR-103a-3p mimic或mimic NC共转染GBC-SD细胞中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.3.3 细胞培养及分组：GBC-SD细胞用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，将细胞置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，在细胞密度85%左右传代，细胞传代3次进行实验。

实验分五组：对照组、mimic NC组、miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1 组、miR-103a-3p mimic+SIX4组。对照组GBC-SD细胞正常培养，mimic NC组GBC-SD细胞Lipofectamine®2000试剂盒转染50 nmol/L mimic NC，其余各组Lipofectamine®2000试剂盒转染50 nmol/L miR-103a-3p mimic，miR-103a-3p mimic组转染至正常培养GBCSD细胞，miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组转染至已经转染过pc DNA3.1空载体且稳定表达的GBC-SD细胞，miR-103a-3p mimic+SIX4组转染至已经转染过pc DNA3.1-SIX4质粒且稳定表达的GBC-SD细胞，转染6 h，更换为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h，进行后续研究。

1.3.4 qRT-PCR检测细胞中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平：“1.3.3”细胞处理后，加1 mL Trizol，提取总RNA，参考“1.3.1”检测细胞中SIX4 mRNA、miR-103a-3p水平。

1.3.5 蛋白印迹法检测细胞中SIX4蛋白水平：“1.3.3”细胞处理后，添加蛋白裂解液，冰上孵育10 min，12 000 r/min 4 ℃离心20 min，上清为总蛋白，BCA蛋白试剂盒对总蛋白浓度进行测定。25 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，蛋白转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；添加SIX4、GAPDH一抗，置于4 ℃孵育过夜；洗涤后添加对应二抗，常温下孵育1 h。DAB显色试剂盒显色，蛋白凝胶成像系统拍照和定量分析。

1.3.6 CCK-8法检测细胞增殖情况：按照1.3.3处理细胞后，离心收集细胞，细胞浓度稀释成1×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，只添加培养液孔为空白组，培养相同时间，加入CCK-8试剂后继续培养2 h，酶标仪中450 nm处测定溶液吸光度（optical density，OD）值。

1.3.7 Transwell检测细胞侵袭情况：Transwell小室经基质胶包被后放入24 孔板中。按照“1.3.3”处理细胞后，离心收集细胞，细胞用单纯的RPMI 1640培养液稀释成5×103个/mL，每孔500 μL接种于Transwell小室上层，小室下层添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，24孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，取出细胞，结晶紫染色5 min，蒸馏水清除背景色，显微镜下拍照并计数。

1.3.8 蛋白印迹法检测细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平：按照“1.3.5”方法检测细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平，一抗为Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9、GAPDH。

1.4 统计学分析

统计学软件GraphPad 9.0 对数据进行分析。计量资料以（）描述，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；采用Person相关性分析检测SIX4与miR-103a-3p的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆囊癌及癌旁组织中SIX4 mRNA、miR-103a-3p表达情况

与癌旁组织相比，胆囊癌组织中SIX4 mRNA水平升高（t=21.795，P＜0.001），miR-103a-3p水平降低（t=20.753，P＜0.001），见图1。SIX4与miR-103a-3p表达呈负相关（r=-0.419，P=0.017），见图2。在癌症体细胞突变目录（COSMIC）数据库的168个胆囊癌样本中，SIX4 mRNA的平均水平为（2.87±0.64），miR-103a-3p的平均水平为（0.49±0.05）；Person分析结果显示，SIX4与miR-103a-3p表达呈负相关（r=-0.154，P=0.046），见图3。

图1 胆囊癌（n=32）及癌旁组织（n=32）中SIX4 mRNA（A）、miR-103a-3p（B）水平比较

图2 临床胆囊癌组织样本（n=32）中SIX4 mRNA与miR-103a-3p的相关性分析

图3 COSMIC数据库中胆囊癌样本（n=168）SIX4 mRNA与miR-103a-3p的相关性分析

2.2 双荧光素酶验证miR-103a-3p与SIX4的靶向关系

TargetScan分析发现，SIX4 mRNA的3’UTR含有miR-103a-3p序列保守碱基，见图4A。双荧光素酶实验验证二者的靶向关系，结果显示，与mimic NC+SIX4 3’UTR-WT相比，miR-103a-3p mimic+SIX4 3’UTR-WT细胞荧光素酶相对活性下降（F=48.728，P＜0.001），见图4B。

图4 miR-103a-3p与SIX4的靶点预测（A）和靶向关系验证（B）

2.3 各组细胞中SIX4、miR-103a-3p表达情况

5组间比较，SIX4 mRNA（F=82.606，P＜0.001）和蛋白（F=229.772，P＜0.001）水平及miR-103a-3p水平（F=48.603，P＜0.001）差异均具有统计学意义。分别与对照组、mimic NC组相比，miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组、miR-103a-3p mimic+SIX4组细胞中SIX4 mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05），miR-103a-3p水平升高（P＜0.05）；分别与miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组相比，miR-103a-3p mimic+SIX4组细胞中SIX4 mRNA和蛋白水平升高（P＜0.05），miR-103a-3p水平降低（P＜0.05），见图5。

图5 各组细胞中SIX4 mRNA（A）和蛋白（B）、miR-103a-3p（C）水平比较（n=6，）

2.4 各组细胞增殖情况

5 组细胞OD450值比较，差异有统计学意义（F=25.985，P＜0.001）。分别与对照组、mimic NC组相比，miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组细胞中OD450降低（P＜0.05）；分别与miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组相比，miR-103a-3p mimic+SIX4组细胞中OD450升高（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞增殖情况比较（n=6，）

2.5 各组细胞侵袭情况

5组细胞侵袭数量比较，差异有统计学意义（F=96.255，P＜0.001）。分别与对照组、mimic NC组相比，miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组、miR-103a-3p mimic+SIX4组细胞侵袭数量降低（P＜0.05）；分别与miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组相比，miR-103a-3p mimic+SIX4组细胞侵袭数量升高（P＜0.05）。见图7、图8。

图7 各组细胞侵袭情况（×200）

图8 各组细胞侵袭数量比较（n=6，）

2.6 各组细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表达情况

5组细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平差异有统计学意义（F=18.133、80.484、27.124、68.126，均P＜0.001）。分别与对照组、mimic NC组相比，miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平，miR-103a-3p mimic+SIX4 组细胞中PCNA蛋白水平降低（P＜0.05）；分别与miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic+pc DNA3.1组相比，miR-103a-3p mimic+SIX4 组细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05）。见图9。

图9 各组细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白水平比较（n=6，）

3 讨论

目前治疗胆囊癌的有效方法是胆囊癌根治性切除术，但只对早期胆囊癌有较好的治疗效果，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者尚无手术指征[8-9]。胆囊癌初期无明显症状，发现时往往已至晚期，不再适合手术治疗，且晚期患者常出现淋巴结及远处转移，导致其预后较差[10]。因此，寻找新的治疗方法及靶点对于胆囊癌的治疗具有较高意义。

目前，许多研究证明miRNA畸变与胆囊癌进展有关。Jiang等[11]报道，与相邻的正常组织相比，miR-365在人类胆囊癌组织中的表达降低，miR-365可能具有抑制肿瘤的作用。Li等[12]研究发现，miR-188-5p在人胆囊癌组织中表达下调，miR-188-5p通过靶向Wnt2b和Smad2 在胆囊癌中发挥抑癌作用。Zong等[13]发现，miR-125b在胆囊癌组织中下调，是胆囊癌进展的抑制因子。以上研究均提示miRNAs可能被用作胆囊癌的治疗标志物。有研究已经揭示miR-103a-3p在前列腺癌[14]、甲状腺癌[15]中均影响癌细胞增殖、侵袭、迁移，为疾病治疗提供新靶标，但目前尚缺少其在胆囊癌中作用的研究。本研究发现，miR-103a-3p在胆囊癌组织中低表达，推测低表达miR-103a-3p可能影响胆囊癌的发生发展。深入研究发现，在胆囊癌细胞中过表达miR-103a-3p可以抑制癌细胞的增殖和侵袭，这与其在非小细胞肺癌中的研究[16]正好相反，推测其可能是由于细胞类型不同导致miR-103a-3p的表达趋势发生改变。本研究进一步验证了细胞增殖、侵袭的蛋白表达情况。Ki-67、PCNA作为增殖标志蛋白，Ki-67高表达与肿瘤细胞周期、肿瘤转移关系密切，PCNA在细胞增殖启动中发挥重要作用[17]；MMP2 作为重要的Ⅳ型胶原酶，分泌过多会促进肿瘤扩散和转移[18]；MMP9 参与肿瘤细胞穿透基底膜和血管，可促进肿瘤发生和发展[19]。本研究发现，在胆囊癌细胞中过表达miR-103a-3p可抑制细胞中Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表达，与增殖、侵袭实验结果一致，证实miR-103a-3p可通过下调相关蛋白表达抑制胆囊癌细胞增殖和侵袭。

miRNA通过结合靶基因的3’UTR调控靶基因的转录或翻译，进而调控疾病。既往研究揭示了miR-103a-3p在各种肿瘤中的多个靶点，如非小细胞肺癌中的CCNE1[20]、胶质瘤中的PDK4[21]。在本研究中，生物信息学分析预测SIX4 3’UTR是miR-103a-3p的潜在结合位点，并经双荧光素酶验证了这一预测。SIX4作为同源盒基因家族成员之一，最早发现其可调控Na+/K+-ATP酶亚基的表达[22]；SIX4在肝细胞癌组织中表达高于癌旁组织和远端正常组织，且其表达水平与预后关系密切，可作为临床预测肝细胞癌预后的指标[23]；食管鳞状细胞癌中SIX4 表达上调，可促进食管鳞状细胞癌的肿瘤生长和细胞转移[24]。上述研究说明SIX4可能是一种促癌因子。在本研究中，胆囊癌组织中SIX4 表达上调，推测SIX4 可能影响胆囊癌疾病进展并参与介导miR-103a-3p抑制胆囊癌进展的过程。此外，在miR-103a-3p过表达基础上SIX4表达升高可促进细胞增殖、侵袭，并上调Ki-67、PCNA、MMP2、MMP9蛋白表达，提示miR-103a-3p可能通过抑制靶基因SIX4 从而抑制胆囊癌细胞增殖、侵袭，实现对疾病的缓解。

综上所述，本研究发现胆囊癌组织中miR-103a-3p低表达、SIX4 高表达，在胆囊癌细胞中过表达miR-103a-3p后能抑制SIX4的表达，从而降低胆囊癌细胞增殖、侵袭，发挥抗肿瘤作用。本研究为胆囊癌的发生提供了可能的新机制，为胆囊癌患者提供了可能的治疗靶点。越来越多的证据表明，miRNA替代疗法（miRNA活性的提高）可以恢复失去的功能，是一种非常有前途的癌症治疗方法[25]。因此，本研究结果为miR-103a-3p胆囊癌替代治疗研究提供了理论依据。然而，对于miR-103a-3p替代治疗的临床应用，miRNA的体内传递仍然是一个很大的挑战。此外，还需要进一步的实验来分析miR-103a-3p在体内对胆囊癌的抗肿瘤作用，以开发从实验室到临床的新的治疗策略。再者，miR-103a-3p靶基因较多，亦可能通过别的基因发挥作用，发现更多与胆囊癌关系密切的靶基因也是本研究未来的重点。