王君杰 王海岗 陈 凌 胡奋山 闫志明 乔治军

(山西农业大学农业基因资源研究中心/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031)

文章编号：1000-8551(2022)12-2330-08

谷子(Setariaitalica)起源于我国，具有抗旱、耐盐、耐瘠薄、水分利用率高等特点，同时具有营养均衡、粮饲兼用等特点，在距今6 000～7 000年的新石器时代早中期完成了驯化，并逐步取代黍稷成为农耕文化的主栽作物[1-3]。随着生活水平的不断提高，人们对健康食品、功能食品的需求越来越高，谷子等杂粮作为营养健康食品，其消费需求不断上升[4]。谷子较水稻、玉米、小麦等作物在基础研究、种植面积等方面具有一定差距，但在小杂粮中占主导地位。我国谷子产量约占世界总产量的80%，种植区域主要分布在我国北方干旱及半干旱地区，其中2/3种植在华北最严重的干旱地区[5]。目前，我国保存有谷子种质资源28 915份，占世界总量的73%，保存量占世界第一[6]。由于谷子属于二倍体，基因组大小约为423 Mb[7]，同时具有C4高效光合特性，势必推动谷子作为模式作物进行研究，且其功能基因的挖掘将成为谷子的重要研究方向，因此，构建谷子突变体库有助于丰富谷子遗传多样性和功能基因的挖掘，可为谷子分子生物学、细胞遗传学、基因组学的研究提供材料。

甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变是目前最有效的化学诱变技术之一，具有突变率高、操作简单、育种成本低等优点[8]，但EMS突变具有很大的随机性，以及突变方向不确定性[9]。前人在水稻[10]、小麦[11]、谷子[12]、大豆[13]等作物上通过EMS诱变技术选育出优质高产的新品种。此外，前人利用谷子突变体材料已挖掘出窄颖花[14]、小穗[15]、黄叶色[16]、类病斑[17]、穗顶端败育[18]、条纹叶[19-20]等性状的功能基因。杨慧卿等[21]建立了谷子突变体信息平台，为育种工作者提供了丰富的优异资源，但平台缺乏主茎节数、单株秆重等田间性状及品质性状数据，需进一步补充完善。

前人对谷子EMS诱变的最佳条件已有报道，王军等[12]和李伟等[22]研究指出1.0%的EMS浓度处理8 h能获得大量谷子突变体材料；李颜方等[23]研究发现最佳的谷子诱变条件为1.0%处理10 h；王春芳等[24]阐明不同谷子品种对EMS 的敏感性不同，冀谷31的最佳诱变条件为1.0%处理6 h，冀谷25的最佳诱变条件为0.8%处理10 h。

突变体是作物遗传学研究中必不可少的重要材料，需要不断进行完善和扩充。目前EMS突变体库的构建主要集中在豫谷1号、晋谷21和长农35等谷子材料。鉴于此，本研究以晋谷40为试验材料，该品种米色金黄，穗型为纺锤形，抗旱性强，抗逆性优于晋谷21[25]，采用1%的EMS诱变浓度处理10 h，旨在建立以晋谷40为背景的突变体库；同时，为了筛选出高产、早熟、矮秆和适应机械化的谷子材料，本试验以筛选的晋谷40矮秆突变体材料为背景，测定成熟期不同诱变材料的主穗长、穗粗、单株穗重、单株粒重和千粒重，分析产量指标的差异变化，以期为育种家和遗传学家提供优异的突变材料。

1 材料与方法

1.1 种子处理

以晋谷40号为试验材料，由山西农业大学经济作物研究所提供。2019年选用500 g籽粒饱满的种子进行EMS诱变：利用Na2HPO4和NaH2PO4配置pH值为7.0的磷酸缓冲液；把种子分成5份，每份100 g，分别放入5个1 000 mL的广口瓶，每个广口瓶加200 mL磷酸缓冲液、2 mL EMS；把广口瓶放在摇床上处理10 h，使种子充分吸收药剂；10 h后在广口瓶中加入硫代硫酸钠对药剂进行中和，把诱变种子装入纱网袋用自来水冲洗0.5 h，自然晾干备用。

1.2 试验设计

于2019和2020年的5-10月在山西省忻州市定襄县良种场进行谷子种植，当年收获后单株分别为M1和M2代；2020年11月-2021年3月在海南三亚利国镇冲坡村对M2代单株进行种植，收获后为M3代；2021年5-10月在忻州定襄良种场对M3代单株进行种植，收获后为M4代。定襄土壤性质为壤土，三亚为砂土，温度、光照、水分等环境资源适宜谷子的生长发育。2019年谷子播前施有机肥羊粪3×105kg·hm-2和复合肥(氮∶磷∶钾N∶P∶K=28∶6∶6)3 000 kg·hm-2，5月27日播种，10月11日收获，M1代运用精量播种机进行单株穴播，株距10 cm，行距30 cm，使单株在生长发育期间表型充分表达，谷子生育期间不间苗，在5叶期和拔节期进行中耕除草，抽穗期进行起垄培土，M1代与亲本有明显表型变异的单株进行挂牌记载，第一株突变体编号为E1，以此类推，成熟后其他单株混合收获。2020年对2019年收获的M1代单株进行单穗种植，种植2行，行长2 m，混合收获的种子进行单株穴播，种植方式和田间管理同2019年一致，对M2代的表型突变单株挂牌记载。在M2～M4代对筛选的变异单株种植2行，行长2 m，从每个变异材料的穗行中筛选1个优异单穗进行套袋，防止异交用于加代繁殖。

1.3 性状调查

M1～M3代在谷子生育期间调查抽穗期、茎粗、成熟期、株高、籽粒颜色、穗型、抗逆性、刚毛、不育性、穗轴、颖壳色、紧实度等差异表型性状，并在成熟期单穗收获，剩余单穗混合收获。M4代对稳定的中矮杆变异材料进行主穗长、穗粗、单株穗重、单株粒重和千粒重的测定。

1.4 数据处理

用Excel 2007对试验数据进行整理，用 DPS 6.50 统计软件对数据进行方差分析，采用SPSS 20统计软件对数据进行相关性分析，采用Origin 2021软件进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 突变体材料的筛选及分类

2019—2020年对M1和M2代诱变材料进行表型差异材料的筛选，表型差异主要分为株高、穗型、茎粗、不育性、刚毛、抗拿扑净、颖壳色、抽穗期、生育期、籽粒颜色、紧实度、抗逆性、单株穗重13类，共332个表型突变单株。图1中，CK为晋谷40叶片正常生长状态；病害表现为叶片自下而上叶尖和边缘呈黄色(图1-A)；株高表现为较亲本材料主茎长明显缩短(图1-B)；抽穗期表现为较亲本材料抽穗早或晚(图1-C)；图1-D为特早熟材料，生育期仅为64 d，且植株矮小；图1-E为抗拿捕净材料，在谷子4叶期喷洒拿捕净除草剂选育而成；图1-F为变异材料单株穗重明显高于亲本材料，具有明显的增产优势；图1-G为谷子不育材料，表现为半不育和高度雄性不育；紧实度表现为穗轴上小穗之间排列紧密(图1-H)；穗型变异表现为亲本材料的纺锤形突变为长鞭形和直筒形(图1-I、J)；图1-K表现为突变材料刚毛变长。

注：CK:正常植株；A:抗逆性；B:株高；C:抽穗期；D:生育期；E:抗除草剂；F:单株穗重；G:不育性；H:紧实度；I:穗型1；J:穗型2；K:刚毛。Note: CK: Normal plant. A: Stress resistance. B: Plant height. C: Heading. D: Growth period. E: Herbicide resistant. F: Panicle weight per plant. G: Sterility. H: Compactness. I: Panicle type 1. J: Panicle type 2. K: Bristly.图1 不同突变体材料的表型性状Fig.1 Phenotypic traits of different mutant materials

2.2 突变体表型变异分析

由表1可知，EMS处理的各个表型性状变异系数明显高于亲本晋谷40(CK)，表明表型性状受EMS诱变的影响较大，以此方法可以获取较多的突变材料。以抽穗期的变异系数最小，CK和EMS处理分别为0.79%和11.03%，可能是由于抽穗期较其他表型性状受更多基因控制，基因调控网络较复杂，导致抽穗期突变频率较小；以EMS诱变的株高变异系数最大，为41.25%。

表1 表型性状变异系数分析Table 1 Analysis of variation coefficient in phenotypic traits /%

2.3 产量指标的差异分析

在矮秆突变体材料中，筛选出茎粗、穗型、成熟期、刚毛、粒色等差异明显的20份突变体材料(表2)。以M4代稳定的中矮秆突变体为研究材料，测定了成熟期中矮秆材料的主穗长、穗粗、单株穗重、单株粒重和千粒重，对筛选的20份突变材料和CK进行方差分析，由图2可知，EMS诱变处理能明显改变谷子穗型，主要变异的穗型为鞭形(E-60)、直筒形(E-107)和棍棒形(E-40)。其中E-60的主穗长最长，为36.17 cm，穗型为长鞭形，较CK增长48.66%，显著高于其他材料；E-68的主穗长最小，为17.83 cm，较CK减小26.72%，穗型为直筒形。亲本晋谷40的穗型为纺锤形，突变体的穗型包括纺锤形、长鞭形、直筒形和棍棒形，可见该变异材料为谷子穗型的分子生物学研究提供了基础材料。

表2 不同矮秆突变体材料的表型特性Table 2 Phenotypic characteristics of different dwarf mutant materials

注：不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significantly difference at 0.05 level. The same as following.图2 不同材料的主穗长分析Fig.2 Analysis of main spike length for different materials

由图3可知，不同变异材料的穗粗与穗型密切相关，直筒型的穗粗优于纺锤形。以突变体材料E-68的穗粗最大，为4.19 cm，穗型为直筒形，显著高于其他突变体材料(E-98除外)，较CK增高12.33%； E-77 穗粗最小，为2.15 cm，较CK减小42.36%。E-77 的穗型为纺锤形，与亲本晋谷40一致，穗的大小和株高均显著低于亲本，初步认为E-77为晋谷40的矮化材料。

图3 不同材料的穗粗分析Fig.3 Analysis of spike diameter for different materials

单株穗重和单株粒重是影响作物产量的主要指标之一，其重量大小直接决定产量的高低。由图4可知，单株穗重和单株粒重都以突变体材料E-98的最大，分别为47.66和39.47 g，较CK增加29.90%和28.36%；以E-77的最小，分别为15.92和13.84 g，较CK减小56.61%和54.99%。不同突变体材料之间单株穗重和单株粒重差异较大，单株穗重和单株粒重与产量密切相关，产量随着穗粒重的增加而增加，可以筛选穗粒重大的突变体材料作为谷子高产的重要材料，E-13和E-58具有早熟特性，单株穗重和单株粒重仅次于E-98，穗型均为纺锤型，与亲本一致，可以把其作为谷子矮秆、早熟和高产新品种选育的理想材料。超早熟和超矮杆材料由于其生育期短、植株矮小等特性，严重减少植株生物量的积累，从而影响产量性状指标(穗粒数、千粒重)的增加，最终导致产量减低，如E-77变异单株，虽然其不能直接应用于大田生产，但可以作为分子生物学研究、挖掘株高和抽穗基因的优异材料。

图4 不同材料的单株穗重和单株粒重分析Fig.4 Analysis of panicle weight and grain weight per plant for different materials

作物产量与千粒重呈正相关，即穗粒数一定的情况下，千粒重越大，产量就越高。由图5可知，以突变体材料E-39的千粒重最大，为3.77 g，显著高于其他突变体材料(E-71和E-78除外)，较CK增高15.16%，E-68千粒重最小，为2.97 g，较对照CK减小9.17%。E-68穗型为直筒形，虽然穗粗值最大，但其主穗长和千粒重最小，一定程度减小了单株穗粒重。

图5 不同材料的千粒重分析Fig.5 Analysis of 1 000 grain weight for different materials

2.4 产量性状的相关性分析

影响作物产量的主要因素有亩穗数、穗粒数和千粒重，但不同性状对产量具有不同程度的影响，彼此之间既相互联系，又相互制约。由表3可知，产量指标间具有显著的相关性，单株穗重和单株粒重呈极显著正相关，相关系数达到0.99；穗粗与单株穗重和单株粒重呈极显著正相关，相关系数分别为0.68和0.62；主穗长和千粒重呈显著正相关，相关系数为0.45，与单株穗重和单株粒重呈不显著正相关；千粒重与穗粗、单株穗重和单株粒重呈不显著负相关。综上可知，作物获得高产的穗型理想指标为穗粒重高、穗粗壮、粒数多、主穗长、千粒重大。

表3 产量指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between yield indexes

3 讨论

王军等[12]和王春语等[26]报道指出，由于EMS处理的M1代突变类型为杂合体，且大多数突变属于隐形突变，不宜鉴定，所以表型差异不明显，一般不进行田间选择。本研究在M1代筛选出1株特早熟矮秆的变异材料，且在M2～M4代表现出性状稳定遗传，推测该基因型为显性纯合体。EMS诱变为点突变，突变后代较易稳定，McCallum等[27-28]利用靶向基因组中诱导的局部病变(targeting induced local lesions in genomes，TILLING)方法解除了化学诱变点突变的限制，能快速有效地从突变群体中鉴定出点突变；Greene等[29]证实了TILLING方法的稳定性和可靠性。本研究中M4代多个突变体材料性状基本稳定，得益于EMS具有突变范围广且突变性状稳定等优点，得到了基于谷子矮杆的20个突变体材料，用于产量性状的评价分析。由于本研究主要通过田间表型数据筛选突变体，缺乏分子水平的鉴定，Taheri等[30]综述了TILLING技术结合高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)和下一代测序(next-generation sequencing，NGS)技术在诱变育种中筛选突变体和发现SNP的应用，因此下一步需结合生物技术，对EMS突变体进行筛选和鉴定。

晋谷40号具有商品品质好、食味品质优等特性，但具有生育期长、植株高等劣势。本试验利用EMS诱变晋谷40号，筛选出以矮秆为背景的20份优异突变体材料，包含了粒色、穗型、成熟期、刚毛等表型性状。穗型的变化显著减低了单株穗重和单株粒重，相吉山等[31]通过EMS诱变研究了谷子突变体穗型、穗码紧实度、穗下节间长度等表型性状和千粒重、主穗重等产量性状，突变体的表型具有显著差异，穗型的变化显著降低谷子穗粒重，这与本试验结果基本一致。

生育期长一定程度上限制了作物种植的广适性。晋谷40号由于其生育期较长，仅适合种植在无霜期长的地区。本试验通过EMS诱变晋谷40号，筛选出早熟、高产的突变体材料，E-13和E-58的选育给育种家和分子生物学的研究提供了基础材料。张彬等[32]研究得出EMS诱变糜子后，在M2代发现一株超早熟变异材料，生育期仅为55～60 d，比对照缩短了约30 d，为糜子广适性育种提供了材料；本试验得出在M1代发现一株矮秆、早熟的谷子材料，比对照生育期缩短了约48 d。因此，可利用上述早熟材料改良晋谷40号的生育期，从而提高该品种种植的广适性。

本研究发现突变材料E-68穗型为直筒形，虽然穗粗值最大，但千粒重最小。相吉山等[31]和Xiang等[33]研究表明改变谷子穗型后，千粒重显著减低，这与本试验结果一致。突变体E-77的产量性状均较小，穗型与亲本一致，株高显著低于亲本，初步鉴定为晋谷40的矮化材料。株高矮化是谷子抗倒伏性的重要指标之一，该突变材料的选育对亲本分子机制的研究具有重要意义。

谷子突变体的表型主要集中在苗期性状(白化苗)、茎秆性状(株高、分蘖性、茎粗、节数)、叶片性状(叶鞘色、叶型)、穗型性状(穗长、穗粗、穗紧实度、穗型、单株穗重、单株粒重、千粒重)、籽粒性状(粒色、米色、粒型)、生理性状(抗逆性、育性、生育期)[5]。本研究筛选出刚毛长短、抗拿扑净、黄粒色和褐米色的谷子突变体材料，在一定程度上丰富了谷子的遗传多样性。目前，前人的研究主要集中在表型鉴定，缺乏品质性状的鉴定，所以今后更多地需要对品质性状进行鉴定。

4 结论

本研究通过EMS诱变晋谷40，在M1代筛选出表型差异明显的332个优异单株；M4代测定了20个矮秆突变体材料的产量性状指标，得出3个矮秆、早熟、高产的理想育种材料，分别为E-13、E-58和E-98；E-77 初步定为亲本晋谷40的矮化材料。