刘鹏飞 范 蓓 刘湘丹 杨 洋 卢 聪 佟立涛 孙 晶，* 王凤忠,*

(1 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2 中国农业科学院农产品加工研究所/农业农村部农产品加工质量安全风险评估实验室/农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室，北京 100193)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimaura et Migo)是我国的名贵中药材之一，主要分布在安徽、浙江、云南、湖南、福建、广西、四川等地[1]，具有滋阴养津、增强体质、补益脾胃、延年益寿等功效[2-3]，是“中华九大仙草”之魁首。铁皮石斛中含有多种营养成分，如多糖[4]、酚类[5]、核苷类、苯丙素类、甾类、氨基酸、矿质元素和生物碱[6]、联苄类[7]等。现代药理学研究表明，铁皮石斛在抗氧化[8]、抗肿瘤[9-10]、降血糖[11]、降血压[12]、抗胃黏膜损伤[13]等方面均具有较好的活性，其中在降血糖方面的作用尤其突出，产生了“治消止渴汤”、“石斛汤”等经典名方治疗消渴症。

铁皮石斛鲜条由于易腐等特性，常加工成枫斗出售。“枫斗”即铁皮石斛鲜条除去杂质，剪去部分须根，边加热边扭成螺旋形或弹簧状，烘干后的加工品。中国农业科学院农产品加工研究所食物营养与功能性食品创新团队研究发现，铁皮石斛加工成枫斗后，不但口感、耐储性得到极大优化，而且对α-葡萄糖苷酶的抑制率增强19.55%(样品浓度为5 mg·mL-1时，铁皮石斛枫斗和鲜条的抑制率分别为68.55%和49.00%)(未发表)。因此，铁皮石斛枫斗加工前后抑制α-葡萄糖苷酶活性的相关成分亟需进一步研究。

枫斗制作过程中，经过了干燥、加箍、烘烤、晾晒等多道工序[14-16]。有学者研究发现，随着干燥温度的升高和时间的延长，铁皮石斛的成分会发生变化，多糖、游离氨基酸和总氨基酸的保留率总体呈现下降趋势，甘露糖和鼠李糖含量减少，核糖和半乳糖含量增加[17]。除了多糖、单糖等糖类成分之外，铁皮石斛中联苄、黄酮等小分子次级代谢产物的作用也不容忽视，而这些成分在枫斗加工过程中的变化规律仍鲜见研究。

本研究采用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)技术，测定铁皮石斛鲜条和枫斗中的主要小分子代谢产物，结合化学计量学方法，挖掘二者的差异性成分并进行规律性分析，以期明确铁皮石斛枫斗的加工意义，为阐明铁皮石斛降血糖物质基础提供数据支撑，为促进我国铁皮石斛精深加工和产业发展作出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

对照品柚皮素、石斛酚、芫花素、山药素Ⅲ，质量分数≥ 98%，上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色谱纯)，德国Merck公司；甲醇(色谱纯)，江苏汉邦科技有限公司。

铁皮石斛鲜条采自云南省龙陵县，经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为铁皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF MS超高效液相色谱串联质谱仪(二元高压泵、自动进样器、柱温箱)，美国Waters公司；Mili-Q 超纯水仪，美国Millipore公司；BO-500S2高速多功能中药粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；5430R小型离心机，德国Eppendorf公司；YQ-ZJ-107电子天平，广州广电计量检测股份有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 铁皮石斛鲜条和枫斗粉末的制备

1.3.1.1 铁皮石斛鲜条粉末的制备 取适量新鲜的铁皮石斛，随机分成6份，切成厚度3～5 mm的斜片，-18℃ 预冻10 h后，置于真空冷冻干燥机中干燥，用高速粉碎机打碎，过65目筛，即得铁皮石斛鲜条粉末。

1.3.1.2 铁皮石斛枫斗粉末的制备 取适量铁皮石斛鲜品，随机分成6份，切成8～10 cm长条，文火加热，待石斛软化后，边加热边用手搓去薄膜状叶鞘使其成螺旋形或弹簧状，再进行高温烘干，即得铁皮石斛枫斗。将其用高速粉碎机打碎，过65目筛，即得铁皮石斛枫斗粉末。

1.3.2 溶液的制备

1.3.2.1 对照品溶液的制备 分别取柚皮素、石斛酚、芫花素、山药素Ⅲ对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成各成分质量浓度为5 mg·mL-1的对照品溶液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备 称取铁皮石斛鲜条粉末或枫斗粉末约1.0 g，置于50 mL离心管中，加入30 mL无水甲醇，密塞后摇匀，称定重量。超声(功率500 W，频率40 kHz)提取30 min，放冷，称定重量。用甲醇补足失重，摇匀，4 000 r·min-1离心20 min，取上清液，浓缩至干，用甲醇复溶至2 mg·mL-1，用 0.22 μm微孔滤膜滤过，即得铁皮石斛鲜条供试品溶液和铁皮石斛枫斗供试品溶液。分别从铁皮石斛鲜条供试品溶液和铁皮石斛枫斗供试品溶液中取等量溶液，混匀作为质量控制(quality control，QC)样品，平行6次。

1.3.3 检测条件

1.3.3.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱子(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)；柱温35℃；流动相为0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15 min，95%～10% A；15～18 min，10%～0% A；18～23 min，0% A；23～23.01 min，0%～95% A；23.01～28 min，95% A)；流速0.3 mL·min-1；进样量5 μL。

1.3.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(electron spray ionization，ESI)，电源电压和喷雾电压为2.23 kV，鞘气体(氮气)流速28 arb，辅助气体流速8 arb，正离子一级全扫描模式，分子量范围为m/z50～1 200。另将混合对照品溶液和混合供试品溶液做二级质谱分析，有利于色谱峰的鉴定。

1.4 石斛属植物化学成分数据库的数据收集与处理

基于数据库收集文献中石斛化学成分的结构式与理化信息等。在中国知网数据库中以“铁皮石斛”、“流苏石斛”、“鼓槌石斛”、“金钗石斛”、“紫皮石斛”、“叠鞘石斛”、“霍山石斛”为检索词；在PubMed数据库中以“Dendrobium officinale”、“Dendrobium fimbriatum”、“Dendrobium chrysotoxum”、“Dendrobium nobile”、“Dendrobium devonianum”、 “Dendrobium denneanum ”、“Dendrobium huoshanense”为检索词，检索石斛有关文献，经过筛选得到石斛的化学成分。将整理得到的化学成分数据以Mysql5.7作为数据库，使用Druid作为数据库连接池，部署在阿里云ECS服务器，可在线搜索和分析石斛中的化合物。

1.5 数据处理与分析

本研究通过UPLC-QTOF-MS采用正离子模式进行分析，按1.3.3项条件检测供试品溶液和混合对照品溶液。将原始数据导入Progenesis QI 2.3软件进行峰对齐、归一化等处理，搜索前期建立的石斛属植物化学成分数据库(http://39.106.37.83/shihudb/#/homePage)、天然产物数据库(https://bioinfapplied.charite.de/supernatural_new/)、HMDB数据库(https://hmdb.ca/)，根据一级和二级质谱碎片，探究裂解规律，结合对照品比对，鉴定化合物的结构。将得到的峰值数据集输出并导入SIMCA软件，进行无监督的主成分分析(principal component analysis， PCA)和有监督的正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。选取变量权重值(variable influence on projection， VIP)>1，P<0.05的物质作为差异化合物。

2 结果与分析

2.1 化合物数据库的建立

查阅7种常见石斛如铁皮石斛、流苏石斛、鼓槌石斛、金钗石斛、霍山石斛、紫皮石斛、叠鞘石斛的相关文献，整理并建立化合物信息数据库。包括化合物中文名称、英文名称、来源植物、分子式、精确相对分子质量、化合物结构等信息，共收集了443个化合物[18]。

2.2 铁皮石斛鲜条和枫斗的化学计量学分析

铁皮石斛鲜条和枫斗的总离子流图如图1所示。结果表明，出峰时间大多集中在7～20 min，铁皮石斛枫斗大部分的峰面积值比铁皮石斛鲜条高，表明铁皮石斛枫斗的化学成分含量高于铁皮石斛鲜条的化学成分含量。主成分分析得分图(图2-A)显示，铁皮石斛鲜条和枫斗分布离散，R2=0.804，Q2=0.671，PCA模型可靠，说明二者化学成分存在一定差异。

注：1：水苏碱；2：L-苯丙氨酸；3：草质素；4：尼泊金异丁酯；5：柚皮素；6：4,4′-二羟基-3,5-二甲基联苄；7：诺比林A；8：石斛酚；9：对羟基肉桂酸乙酯；10：Fimbriadimerbibenzyl D isomer；11：4,9-二甲氧基菲-2, 5-二醇；12：鼓槌联苄；13：芫花素；14：山药素-Ⅲ；15：Dendronophenol B；16：α-亚麻酸。Note: 1: Stachydrine. 2: L-phenylalanine. 3: Herbacetin. 4: Butylparaben. 5: Naringenin. 6: 4,4′-dihydroxy-3,5-dimethyldibenzyl.7: Norbilin A. 8: Gigantol. 9: P-hydroxyl ethyl cinnamate. 10: Fimbriadimerbibenzyl D isomer. 11: 4,9-dimethoxyphenanthrene-2,5-diol. 12: Chrysotobibenzyl. 13: Genkwanin. 14: Batatasin Ⅲ. 15: Dendronophenol B. 16: α-linolenic acid.图1 铁皮石斛枫斗和鲜条样品的总离子流图Fig.1 Totalion flow diagram of fresh strips and fengdou of D.officinale

为充分提取2组样本间的差异信息，本试验采用OPLS-DA方法对数据进行分析，其结果如图2-B所示。经分析，R2=0.985，Q2=0.976，说明建立的OPLS-DA模型稳健可靠。200次循环置换检验(Permutation)结果如图2-C所示，R2(0.0，0.44)和Q2(0.0，-0.559)，Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴，说明建立的OPLS-DA模型拟合了较多的变量信息，且该模型具有良好的预测能力。

图2 主成分分析得分图(A)、OPLS-DA分析得分图(B)、200次循环置换检验结果(C)Fig.2 Principal component analysis score (A), OPLS-DA analysis score chart (B), 200-cycle replacement test result (C)

2.3 差异成分鉴定

本研究筛选VIP>1，P<0.05的物质作为差异化合物，最终筛选到16种差异化合物，包括8种联苄类成分和3种黄酮类成分(表1)。其中，12个成分在枫斗中含量较高，4个成分在鲜条中含量较高。

图3 联苄类化合物的质谱裂解途径Fig.3 Mass spectrometric cleavage pathway of dibenzyl compounds

2.3.1 联苄类成分鉴定 联苄类成分是石斛属植物中普遍存在的一类成分，2个苯环通过乙基连接，具有抗肿瘤[19]、抗炎[20]、抑制血管新生[21]等活性。此类化合物常在两个苯环间的乙基处发生断裂，生成小分子苯酚类化合物。以化合物8为例，正离子模式下可见准分子离子峰m/z275.128 [M+H]+，推测其分子式为 C16H18O4， 8个不饱和度。该化合物的二级质谱图中m/z151.1的信号中性丢失CH2·，得到m/z137.0；碎片离子峰m/z139.0再中性丢失CH3·得到m/z122.0的碎片。由此推断，该化合物具有联苄的母核，可能A、B环各含有一个羟基和一个甲氧基，结合文献[22]报道信息，推断该化合物为石斛酚，与对照品比对，确定为石斛酚，其可能的质谱裂解途径见图3。同理，鉴定色谱峰 6、7、12、14、15均为联苄类化合物，分别为4,4′-二羟基-3,5-二甲基联苄、诺比林A、鼓槌联苄、山药素-Ⅲ 和dendronophenol B。色谱10准分子离子峰为m/z533.217 [M+H]+，推测其分子式为C31H32O8，16个不饱和度。二级质谱图可见m/z393.2、285.1、239.1的信号，该化合物可能为联苄二聚体，分别丢失C7H7O3、C7H8O、CH2O2基团，进一步与数据库比对，鉴定其为Fimbriadimerbibenzyl D 的同分异构体。

2.3.2 黄酮类成分鉴定 黄酮类化合物的质谱裂解规律已有多篇文献报道[23-24]，通常会中性丢失CO，发生逆狄尔斯-阿德尔反应(retro Diels-Alder reaction, RDA )裂解产生[1,3A]+和[1,3A]-。以色谱峰13为例，正离子模式下可见准分子离子峰m/z285.1 [M+H]+，该化合物的二级质谱图中出现了m/z270.0 [M+H-CH3·]+、257.1 [M+H-CO]+和m/z167.1 [1,3B]+的碎片，结合对照品比对和文献报道[25]，推断其为芫花素。同理，鉴定色谱峰 3、5 也为黄酮类化合物，分别为草质素和柚皮素[26-27]。

2.3.3 其他类成分鉴定 除上述联苄和黄酮两大类成分外，其余差异成分主要为生物碱(水苏碱，1)菲类(4,9-二甲氧基菲-2,5-二醇，11)、酯类(尼泊金异丁酯，4；对羟基肉桂酸乙酯，9)、氨基酸(苯丙氨酸，2)、脂肪酸(α-亚麻酸，16)，具体质谱信息见表1。16 个差异化合物的丰度比较见图 4。

图4 铁皮石斛枫斗和鲜条差异性成分相对含量比较Fig.4 Comparison of the content of different components between fengdou of D. officinale and its fresh

表1 铁皮石斛枫斗与鲜条差异成分鉴定结果Table 1 Identification results of differential components between fengdou of D. officinale and fresh strips

3 讨论

酚类物质在石斛中含量较低，因此本研究利用UPLC-QTOF-MS技术测定样品，采取提取液浓缩至干再复溶的方式，可增加色谱峰的响应值。通过比较正、负离子模式下的总离子流图发现，正离子模式下的色谱峰响应程度高于负离子模式，因此采用正离子模式分析。

本研究采用化学计量学方法进行数据分析，通过分析，铁皮石斛加工和非加工样品在 PCA 得分图上可以得到明显的区分。同时，比较了铁皮石斛枫斗和鲜条的成分差异，以VIP>1、P<0.05 为条件，筛选和鉴定了16种具有显著差异性的化合物，包括联苄、黄酮、酯类等成分。黄酮是石斛中主要的生物活性成分之一，不仅有很强的抗氧化性[28]，还可以降血糖[29]。本研究比较发现芫花素、柚皮素、草质素等黄酮类成分在枫斗中明显上调积累，可能是由以柚皮素、草质素为苷元而形成的糖苷在加工过程中遇热断裂糖苷键，变成游离黄酮所致。联苄类成分是石斛的特征性成分，已被证实具有降血糖[30]、抗肿瘤等[31]药理作用。不同的温度可能会导致联苄类成分羟基化程度不同，从而影响联苄类成分的含量，铁皮石斛枫斗中石斛酚、4,4’-二羟基-3,5-二甲基联苄、鼓槌联苄等相对含量明显高于鲜条，活性成分含量累积更多，药用效果更佳。有研究表明高浓度石斛酚抑制高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡的能力更强[32]。同时，本研究发现α-亚麻酸、L-苯丙氨酸、尼泊金异丁酯等脂肪酸、氨基酸成分在鲜条中相对含量较高，而在枫斗加工过程中含量降低，其原因可能是氨基酸类和脂肪酸类成分在加工过程中受热不稳定，遇热易分解和挥发。

此外，多项研究表明植物中黄酮类[33]、酚类[34]成分与抑制α-葡萄糖苷酶的活性密切相关。本研究发现的铁皮石斛鲜条和铁皮石斛枫斗之间的差异成分，很可能与铁皮石斛降血糖功效具有一定相关性，需要在后续研究中证实。

4 结论

本研究以铁皮石斛为材料，利用UPLC-QTOF-MS技术结合化学计量学方法鉴定出铁皮石斛枫斗和鲜条的16种差异成分，并针对16种差异成分进行分类和相对含量分析。结果表明，铁皮石斛鲜条加工成枫斗后，黄酮、联苄类化合物相对含量升高，脂肪酸、氨基酸类化合物相对含量降低。本研究揭示了铁皮石斛枫斗和鲜条的差异性，有助于阐明其加工的意义，为铁皮石斛的功能性产品开发提供了理论支撑。