曹尚桥 吕 爽 李红波,* 许 龙 刘振彬 胡梁斌 莫海珍,*

(1 陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2 河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450000)

秦川牛是我国陕甘宁地区的优势畜种，年产肉量在50万吨以上[1]。秦川牛瘦肉率高、肉质鲜嫩，越来越受到消费者的喜爱[2]。随着人们对秦川牛肉需求的增加，其加工副产物尤其是牛骨产量增大[3]。牛骨占牛活体质量的6%～12%，富含蛋白质、脂肪、胶原蛋白及钙、磷、铁等矿物质，是天然的食药兼用原料[4]，其开发利用逐渐被重视[5]。秦川牛骨汤[2]、牛骨胶原蛋白肽[6]、骨粉[7]是牛骨主要的制作方式。由于挥发性脂肪酸是造成畜骨腥味的主要原因[8]，因此牛骨的开发利用大都去除油脂，从而造成了资源的极大浪费。利用秦川牛骨油开发高附加值产品、减少环境污染成为人们关注的焦点。

牛骨中的脂肪含量大约占12%～20%，含有油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸[9]。研究表明，不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)尤其是n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)在减少神经炎症[10]、预防心脑血管疾病[11]和治疗骨质疏松[12]等方面有重要功效。与植物油脂相比，牛骨油不仅具有动物油脂特殊的香味，而且富含多种脂溶性维生素、矿物质、脂肪酸等营养物质，具有较大的开发潜力[13]。吕生华等[14]利用牛等动物的骨头在熬炼骨胶时所得油脂制备了硫酸化骨油、硫酸化含硅骨油及亚硫酸化骨油加脂剂，开辟了骨油深加工的新途径。刘文媛等[9]以黄牛骨为原料，采用超声波辅助水热法提取牛骨油并对其进行工艺参数优化，同时对牛骨油的酸值、过氧化值和脂肪酸组成进行分析，提高了骨油提取率并保持较高的骨油品质。但目前国内外对秦川牛腿骨油中的甘油酯及脂质组成鲜有研究，因此本研究以秦川牛腿骨为原料，对牛腿骨油中脂质组成进行综合分析并对部分氧化指标进行测定，以期为牛骨油的高效利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秦川牛腿骨，购自西安市索回德清真食品有限公司；氯仿(≥99.7%)、浓硫酸(98%)、氯化钠(≥99.5%)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT, ≥99.8%)均为分析纯，天津天力化学试剂有限公司；正己烷(≥98%)、甲醇(≥99.9%)为色谱纯，天津科密欧化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

FW-100 D高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；JA2003 N电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；LGJ-10C冷冻干燥机，青岛圣吉仪器系统有限公司；HH-S6L电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；RE100-Pro旋转蒸发仪，四环福瑞科技发展(北京)有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；MD200-1氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司；7000 D气相色谱三重四极杆质谱仪，北京安捷伦科技有限公司；TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪，上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 油脂提取 将牛腿骨表面的肉剔除，用高速粉碎机粉碎后冷冻干燥，-20℃冰箱保存待用。

根据Folch等[15]的方法稍加修改提取秦川牛腿骨的油脂。按照样品∶有机溶剂=1∶15的体积比，向样品中加入一定体积的有机溶剂(氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.75，v/v/v)，加入0.005%的2,6-二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytolyene, BHT)。30℃超声波(40 kHz，100 W)辅助萃取20 min[16]，静置分层，真空抽滤收集下层，利用旋转蒸发仪在40℃下蒸干有机溶剂。每个样品重复3次萃取。

1.3.2 高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分析甘油酯组成 参照Wang等[17]的方法，使用配备Phenomenex Luna硅胶柱(内径250 mm × 4.6 mm × 5 μm)、柱温30℃的正相高效液相色谱(normal-phase high performance liquid chromatography, NP-HPLC，折射率检测器)对酰基甘油物种进行分析。流动相为正己烷∶2-丙醇∶甲酸(21∶1∶0.003， v/v/v)，流速为1 mL·min-1，进样量为10 μL，每个样品的测试持续时间为45 min。

1.3.3 气相色谱-质谱连用(gas chromatography-mass spectromete, GC-MS)分析脂肪酸组成 脂肪酸甲酯化[18]：取20 μL样品于具塞管中，加入1.5 μL 1%的硫酸甲醇溶液，80℃水浴1 h，并不时摇晃。冷却至室温后，依次加入1 mL饱和氯化钠溶液、1 mL去离子水、2 mL色谱纯正己烷。摇匀后静置分层，将上层转移至进样瓶中进行GC-MS分析。

参照Wendlinger等[18]的方法并稍作修改。采用配备有DB-23色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)的安捷伦7000D三重四极杆GC-MS仪进行脂肪酸甲酯分析，全扫描模式(m/z 50～500)下的所有测量均采用以下程序进行：初始温度为130℃，保持1 min；然后以5℃·min-1的速度升至230℃，保持5 min，总运行时间为26 min。用自动进样器以分流模式(1∶20, μL∶μL)进样1 μL。

1.3.4 多维质谱“鸟枪法”(multi-dimensional mass spectrometry-based shotgun lipidomics, MDMS-SL)分析脂质组成 用200 μL氯仿/甲醇(1∶1，v/v)重新提取样品(100 mg)中的油脂[19]。脂质分析在配备了自动纳米喷雾离子源的三重四级质谱仪上进行，并在Xcalibur系统下运行[20]。基于脂质组学原则[21]，通过MDMS-SL对不同脂质类别和单个物种进行鉴定和量化。

1.3.5 理化性质及氧化稳定性测定 参照《GB/T 5534-2008动植物油脂 皂化值的测定》[22]测定皂化值，参照《GB/T 5532-2008动植物油脂 碘值的测定》[23]测定碘值，参照《GB 5009.229-2016食品安全国家标准 食品中酸价的测定》[24]测定酸价，参照《GB/T 12766-2008动物油脂 熔点测定》[25]测定熔点，参照《GB/T 26635-2011动植物油脂 生育酚及生育三烯酚含量测定 高效液相色谱法》[26]测定生育酚及生育三烯酚，参照《GB 5009.227-2016食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[27]测定过氧化值，参照《GB/T 21121-2007动植物油脂 氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》[28]测定氧化稳定性。

2 结果与分析

2.1 甘油酯组成分析

通过HPLC法测定秦川牛腿骨油中的甘油酯组成及含量(图1)。结果表明，样品中含有丰富的甘油三酯(triqcylglyceride, TAG)(93.84%)，少量的甘油二酯(diacylglycerol, DAG)(2.89%)以及游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)(3.27%)，在秦川牛腿骨油中未鉴定到甘油一酯(monoacylglycerol, MAG)。甘油三酯在人体中起到供给能量、储存能量以及固定和保护内脏的作用[29]。研究表明，DAG尤其是1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol, 1,3-DAG)是一种健康的食用油，具有降低血清和肝脏胆固醇含量、降低体内甘油三酯水平及减少体内脂肪堆积的功效[29]。

图1 秦川牛腿骨油中的酰基甘油组成Fig.1 Acylglycerol species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.2 脂肪酸组成分析

由表1可知，秦川牛腿骨油中的脂肪酸组成较为丰富。通过GC-MS在牛腿骨油中共鉴定到24种脂肪酸，其中饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)占总脂肪酸的29.99%，单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)占62.85%，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)占2.18%，其他脂肪酸占4.98%。饱和脂肪酸以C16：0(棕榈酸)和C18：0(硬脂酸)为主，含量分别为19.18%和8.84%；单不饱和脂肪酸以C18：1(油酸)为主，含量达到57.82%，是秦川牛腿骨油中含量最高的脂肪酸；多不饱和脂肪酸含量最高的是亚油酸，含量为2.03%，还鉴定出少量的α-亚麻酸(0.15%)，两种脂肪酸均为人体必需脂肪酸。秦川牛腿骨油中的脂肪酸主要是不饱和脂肪酸，具有降低血液粘稠度、预防心脑血管疾病、提高大脑神经细胞活力等作用。α-亚麻酸属于n-3多不饱和脂肪酸。有研究表明，服用少量的α-亚麻酸即可使体内血压明显降低[30]。因此，秦川牛腿骨油在医药方面具有极大的应用前景。

表1 GC-MS分析秦川牛腿骨油中的脂肪酸组成Table 1 Fatty acids species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones analyzed using GC-MS

2.3 脂质组成分析

通过基于多维质谱“鸟枪法”(MDMS-SL)对秦川牛骨油中的脂质分子进行分析(表2～4)，鉴定到24种酰基肉碱(acylcarnitine，ACar)、17种鞘磷脂(sphingomyelin，SM)以及38种磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)，其中鞘磷脂(35.36 nmol·g-1)和磷脂酰胆碱(22.16 nmol·g-1)的总含量较高，且均属于磷脂。

2.3.1 酰基肉碱的种类及含量 秦川牛腿骨油中酰基肉碱总含量为1.18 nmol·g-1，其中ACar(14：1-OH)和ACar(18：0)的含量最丰富，分别为0.35和0.20 nmol·g-1(表2)。

表2 秦川牛腿骨油中的ACar种类Table 2 ACar species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.3.2 鞘磷脂的种类及含量 由表3可知，鞘磷脂中N16：0和N15：0的含量较多，分别为19.25和2.51 nmol·g-1；N20：0的含量最少，仅有0.02 nmol·g-1。 鞘磷脂在高等动物组织中含量较丰富，是动物细胞膜及其他各种生物膜的主要组成部分[31]。研究表明，当鞘磷脂与胆固醇的微胶溶液浓度相等时，能够显著抑制Caco-2细胞胆固醇的吸收[31-32]。

2.3.3 磷脂酰胆碱的种类及含量 P16:0～16:0是秦川牛腿骨油中占比最大的一种磷脂酰胆碱，含量达到3.73 nmol·g-1；而PC(D18:0～22:3)占比最少，仅为0.01 nmol·g-1(表4)。磷脂酰胆碱又称卵磷脂，具有降低血脂与预防血管疾病、改善脑及神经功能、改善脂类代谢以及抗炎抗氧化的作用。因此卵磷脂含量丰富的秦川牛腿骨油在功能食品的开发、食品包装涂膜材料上有广泛的应用前景[33]。

表3 秦川牛腿骨油中的SM种类Table 3 SM species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

表4 秦川牛腿骨油中的PC种类Table 4 PC species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4 理化性质及氧化稳定性分析

2.4.1 氧化稳定性曲线 油脂的自动氧化是导致其酸败变质的主要因素。氧化稳定性反映油脂抵御自动氧化的能力，即可反映油脂的耐贮性。油脂的氧化稳定性由诱导期到氧化期之间时间的长短决定，诱导时间越长，表明油脂的氧化稳定性越强。由图2可知，秦川牛腿骨油的诱导时间为9.37 h，氧化稳定性较强。

图2 秦川牛腿骨油的氧化稳定性曲线Fig.2 Oxidation stability curve of the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4.2 理化指标测定结果 酸价和过氧化值是评价油脂性质重要的理化指标。由表5可知，秦川牛腿骨油脂的酸价为16.43 mg KOH·g-1，过氧化值为5.22 mmol·kg-1， 碘值为24.84 g·100 g-1。

表5 秦川牛腿骨油的理化指标Table 5 Physical and chemical indicators of the lipids in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4.3 酚类化合物的测定结果 由表6可知，秦川牛腿骨油中具有三种酚类化合物，包括α-生育酚、α-三烯酚和γ-三烯酚，含量分别为2.29、1.75和4.89 mg·kg-1。最近研究发现，生育三烯酚在抗动脉粥样硬化、降血压、抑制心血管炎症等方面有较好的效果[34]，甚至在某些情况下比α-生育酚更优良，且α-生育三烯酚的抗氧化活性是α-生育酚的40～60倍[35]。因此，秦川牛腿骨油可以有效清除脂质细胞膜上的自由基，有一定的抗炎作用。

表6 秦川牛腿骨油中的酚类化合物Table 6 Phenolic compounds of the lipids in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones /(mg·kg-1)

3 讨论

食用油中的甘油三酯含量高达95%～98%，是主要的营养成分，为人体提供能量和必需脂肪酸，其次是甘油二酯和游离脂肪酸[36]。甘油二酯分为1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯两种异构体，其中1,3-甘油二酯在降血脂、减少内脏脂肪、抑制体重增加等方面有重要功能[36]。本研究发现，秦川牛腿骨油中甘油三酯含量约94%，可以被用作一种新的食用油的原料，来维持人体体重以及预防一些心血管疾病。

邢田等[37]研究了牛油中的脂肪酸组成，结果发现饱和脂肪酸含量为52.77%，不饱和脂肪酸为47.23%，其中亚麻酸占1.44%。饱和脂肪酸含量高于不饱和脂肪酸含量，这与本研究的结论相反。刘文媛等[9]研究发现牛骨油中的不饱和脂肪酸含量略高于饱和脂肪酸含量，这与本研究结果相似。说明脂肪酸的检测结果与牛骨油的提取方式以及牛油的来源有密切联系[9-11]。牛腿骨油和牛油中含量最高的脂肪酸均为油酸，油酸对软化血管有一定的功效，在人体新陈代谢过程中也起着重要的作用[11]。研究表明，食用饱和脂肪酸较高的食物可能会引起高血脂、高血压等疾病，而高含量的不饱和脂肪酸会降低动物油脂对人体的危害[38]。秦川牛腿骨油中不饱和脂肪酸含量远高于牛油，约为62%，且含有亚油酸(2.03%)和α-亚麻酸(0.15%)两种必需脂肪酸。因此，牛腿骨油相较于牛油更健康，在食品和医药方面均有极大的开发利用潜力。

卫海莲[39]采用超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱的脂质分析方法从青刺果油中鉴定出磷脂、甘油酯和糖脂三大类脂质，其中包括21种磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、13种PC和1种溶血磷脂酰胆碱(lyso-phosphatidylcholine, LPC)等。本研究采用MDMS-SL检测牛腿骨油脂质组成，检测出磷脂、甘油酯以及酰基肉碱，且酰基肉碱和磷脂种类较为丰富，这与卫海莲[39]的研究结果类似。磷脂具有维持人体基本生命活动，提高人体免疫力，同时延缓衰老的作用。秦川牛腿骨油中丰富的磷脂种类及含量使其在保健品、功能食品等健康领域都有极大的利用潜力。

酸价可作为油脂变质程度的指标，酸价越小，说明油脂质量、新鲜度和精炼程度越好[40]。本研究检测出秦川牛腿骨油酸价为16.43 mg KOH·g-1，与食用动物油的标准相比较高[24]，与何鑫等[41]的研究结果也不完全一致，可能是由于本研究只是粗提取，未进行一系列脱胶、脱酸、脱色和脱臭的油脂精炼过程。过氧化值也能反应油脂的酸败程度[40]。本研究检测到的牛腿骨油中的皂化值和碘值与椰子油类似[42]，因此可以进一步研究其在缓解骨质疏松、抗氧化等方面的作用。而要将秦川牛腿骨油进一步加工成食用油，精炼过程是必不可少的。

4 结论

本研究结果表明，秦川牛腿骨油含有丰富的不饱和脂肪酸、酚类化合物、卵磷脂以及少量的甘油二酯和α-亚麻酸，并且具有较强的抗氧化能力，可能在抗炎抗氧化、降压降血脂等方面有一定的功效。然而，秦川牛腿骨油在功能性食品、医药以及食品涂膜材料上的应用还需进一步探索。