陈金成 张 吟林丽梅 王培红

福建医科大学附属第二医院药学部，福建泉州 362000

万古霉素，一种糖肽类时间依赖性抗生素，其药物代谢动力学/药物效应动力学评价参数为药时曲线下面积/最低抑菌浓度（area under curve/minimum inhibitory concentration，AUC/MIC），其治疗窗较窄，且其药理作用和不良反应在一定程度上与其血药浓度相关，较低的浓度容易诱导细菌产生耐药性，过高浓度又会引起耳、肾毒性，影响万古霉素血药浓度的因素有很多。神经外科术后患者合并使用甘露醇、利尿剂、氨基糖苷类抗生素等肾损害药物的概率较高，尤其ICU患者，需要进行万古霉素血药浓度检测的人群数量较多，而万古霉素血药浓度检测能显著降低耳肾毒性的发生率，因此，临床上为保证药物安全和有效对万古霉素患者进行血药浓度检测就显得十分必要。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（LC-30AD，日本岛津）；CTO-30A进样器（LC-30AD，日本岛津）；SPD-M20A紫外检测器（LC-30AD，日本岛津）；SHB-DIII循环水真空泵（上海申光仪器仪表有限公司）；KQ-500DV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XH-B漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；800台式低速离心机（上海医疗器械集团有限公司）；离心机（2-5k，德国Sigma公司）；超纯水系统（Milli-Qacademic，美国Millipore公司）；分析电子天平（瑞士，梅特勒公司）。

1.2 试药

万古霉素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130360-201302）；内标去甲万古霉素（中国药品生物制品检定所，批号：30338-200303）；空白血浆（福建医科大学附属第二医院体检中心，健康体检者的混合血浆）；乙腈（HPLC级，批号：MS1922-001，美国TEDIA公司）；磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150407）；硫酸锌（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150104）；以上试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex C100 mm×4.6 mm，2.6 μm；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（pH3.2）的梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；柱温：40℃；检测波长：220 nm；进样量：10 μl。采用梯度洗脱法，洗脱程序为时间0.01、3.00、9.25、9.50、13.5、13.75、18.00 min时，分别对应的B相百分比为3%、8%、8%、60%、60%、3%及停止。

2.2 溶液的配置

标准品万古霉素溶液：精密称取万古霉素10 mg 于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的万古霉素溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，置4℃冰箱贮存备用。

内标去甲万古霉素溶液：精密称取去甲万古霉素10 mg于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的内标去甲万古霉素溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，置4℃冰箱贮存备用。

10%硫酸锌溶液：精密称取硫酸锌1 g加超纯水溶解并于10 ml容量瓶中定容，配制成10%硫酸锌溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，置4℃冰箱贮存备用。

2.3 样品前处理

将配置好的万古霉素溶液用超纯水分步稀释，分别配置成20、50、100、200、500、1000 μg/ml的万古霉素溶液。取空白血浆180 μl，依次加入上述浓度的万古霉素溶液20 μl及内标（去甲万古霉素溶液）20 μl，再加入10%硫酸锌溶液50 μl，漩涡震荡30 s，离心（转速：10 900 r/min，半径：10 cm）10 min，取上清液进样。结果见图1~4，计算万古霉素浓度，万古霉素峰保留时间8 min左右，并且与前后峰分离度良好，血浆中的内源性杂质对测定无干扰。

图1 空白血浆色谱图

图2 去甲万古霉素纯样色谱图

图3 万古霉素纯样色谱图

图4 给药患者血浆样品+内标色谱图

2.4 标准曲线的绘制

上述万古霉素溶液加入空白血浆后，依次配制成2.22、5.56、11.11、22.22、55.56、111.11 μg/ml的标准血样，进样后以万古霉素与去甲万古霉素浓度之比为横坐标X，以万古霉素与内标峰面积之比为纵坐标Y，做线性回归，即得直线方程Y=1.33X+0.0056，R= 0.9997（图5）。

图5 万古霉素标准曲线图

2.5 最低定量下限

取万古霉素标准曲线中最低浓度2.22 μg/ml的溶液，用空白血浆进行稀释，按“2.3”项下方法处理血浆，按“2.1”项色谱条件进样检测，在定量下限浓度为2.22 μg/ml浓度下，信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=13.7，符合灵敏度要求。

2.6 精密度与准确度考察

取线性范围内低、中、高三个浓度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）的万古霉素血清标准液。按“2.3”项下方法处理血浆，按“2.1”项色谱条件进样检测，1天之内平行测定5次，计算日内精密度，包括回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。取相同样品连续测5 d，期间于4℃冰箱保存，计算日间精密度。结果见表1，符合方法学要求。

表1 万古霉素日内、日间精密度与准确度（n=5，%）

2.7 稳定性试验

制备低、中、高3种浓度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）万古霉素血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理血浆，按“2.1”项色谱条件进样检测，分别在室温放置4 h、室温放置24 h、反复冻融1次、反复冻融2次的条件下考察其稳定性，结果见表2，在上述条件下万古霉素稳定性良好。

表2 万古霉素稳定性实验（n=5）

2.8 临床应用

患者男，42岁，因脑干出血入福建医科大学附属第二医院ICU，后一般细菌涂片检查出革兰阳性球菌与革兰阴性杆菌，以万古霉素以1.0 g，q12 h静脉滴注进行抗感染治疗，稳态后抽血进行血药浓度检测，测得结果为20.48 μg/ml，结果虽略微超过重症感染时的万古霉素血药浓度范围（15~20 μg/ml），但患者未见肾功能异常，继续此常规治疗方案，患者感染得到有效控制。

患者女，81岁，因急性消化道出血，十二指肠球部溃疡穿孔并脓毒性休克入福建医科大学附属第二医院ICU，后腹水培养结果显示革兰阳性球菌生长，以万古霉素0.5 g，q6 h静脉滴注来抗感染治疗，5 d后抽稳态浓度血予以临床药学室进行血药浓度检测，测得结果为22.14 μg/ml，结合患者检测肌酐清除率较前有所升高，调整万古霉素剂量为0.5 g，q12 h，并注意肾功能监测，结果表明经剂量调整后患者肌酐清除率有所下降。

3 讨论

采用直接沉淀法来处理血样，与固相萃取法相比，此法操作简单省时省力，更加适合于医院用于检测患者血药浓度的模式。在蛋白沉淀剂的选择中，就回收率方面来看，乙腈回收率几乎为0，甲醇、高氯酸的回收率在60%左右，而硫酸锌的回收率超过90%；而就沉淀效果来看，10%硫酸锌的净化效果明显好于20%硫酸锌及30%硫酸锌，故选用直接沉淀法并以10%硫酸锌做蛋白沉淀剂。在有机相的选择中，选用乙腈时的色谱峰要明显好于选用甲醇时，另外，还有文献报道，应用磷酸二氢钾缓冲体系时，其缓冲盐浓度过大会造成盐析，导致柱压升高，影响分离效果，并且，在pH值为3.2时，峰形较为对称，且保留时间较合适，故选用乙腈-磷酸二氢钾（pH=3.2）来作为流动相。

自1958年开始，万古霉素在临床上被用于治疗革兰阳性菌引起的感染，其主要通过抑制细胞壁的合成，改变细胞膜的通透性并影响RNA合成来起到抗菌作用。在应对β-内酰胺类药物抵抗的感染时，万古霉素能起到很好的效果，因而在临床上是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的一线用药。本实验建立了高效液相色谱法来测定人血浆中万古霉素浓度，并成功应用于临床。解决了由万古霉素治疗窗窄引发的一系列问题，实现了万古霉素的个体化给药。另外，基于准确数据来进行用药指导也更能促进临床用药的安全、经济、合理。当然，本研究还存在着很多大的不足跟欠缺，如样本量少，后续应进行大量的临床宣讲提升样本量，更重要的是今后的研究重点应根据药代动力学原理制定剂量调整方案，更好地帮助临床实施个体化给药。