王印壮，费鹏，马艳莉，，牟建楼*，马艳，范成伟，董格格

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南 南阳 473004）

黄精（Polygonatum sibiricum）和山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）同属我国重要的药食两用种质资源。黄精为百合科黄精属（Polygonatum Mill.）植物，富含多种生物活性成分，如黄精多糖、甾体皂苷、黄酮及氨基酸等，研究表明，黄精具有调节血糖、降低血脂、提高免疫力及抗病毒等功效；山楂为蔷薇科山楂属（Crataegus L.）植物，富含黄酮、三萜类、维生素以及有机酸等活性成分，具有改善脂代谢、调节胃肠功能以及预防心脑血管疾病等功效。随着社会的发展和人们健康意识的提高，具有重要生理功能的黄精、山楂等药食同源类资源在食品领域的发展逐渐受到重视。朱建平等以黄精、山楂及牛奶为原料开发出口感、色泽以及风味俱佳的新型酸奶产品，并研究其对高脂大鼠模型的降脂作用，发现其具有良好的降脂功能。张建萍等采用单因素及正交试验设计，以黄精、山楂为原料，研发出一种具有独特口感、发酵醇酯香的黄精山楂功能保健酒。此外，研究还发现黄精和山楂配合使用，对于调节高脂血症、改善胃肠功能以及亚健康等具有积极作用。因此，以黄精、山楂为主要原料，联合开发具有功效作用的新型食品具有广阔市场前景。

食用植物酵素是指以水果、蔬菜、药食同源类植物等为原料，经有益微生物发酵制得的含有酚类、多种功效酶以及氨基酸等生物活性成分的产品，具有抗氧化、解酒护肝以及润肠通便等功效。酵素通过发酵剂的发酵作用将原料中的物质进行分解，形成各种生理活性产物释放于基质之中，同时还可保留发酵益生菌，使其既具有功能性又富含风味成分。因此，可以考虑以黄精、山楂为原料，通过乳酸菌的发酵制备集聚风味和功能性的新型复合酵素，从而拓展黄精与山楂在食品领域中的应用。

综上，本研究通过考察不同乳酸菌的生长性能和耐酸特性，筛选出两株具有良好发酵性能的乳酸菌用于制备酵素；以黄精、山楂为主要原料，采用单因素试验，分析菌种体积比、黄精与山楂质量比、接种量、发酵温度和发酵时间对复合酵素总黄酮含量和感官评分的影响；利用响应面试验优化得出最佳发酵工艺参数，并对其发酵前后感官品质、基本理化指标及功能性成分的变化进行分析，以反映其品质变化，从而制备出一种具有良好风味和营养保健功能的新型黄精山楂复合酵素产品，以期促进黄精、山楂在食品领域的发展，为黄精山楂复合酵素的工业化生产提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精（一蒸一晒）：河南联源生物科技股份有限公司，经鉴定为百合科黄精属植物黄精（Polygonatum sibiricum Red.）；山楂干、红糖：市售。

植物乳杆菌ACCC 11095、植物乳杆菌AS 1.2437、类干酪乳杆菌CICC 21019、干酪乳杆菌ATCC 334、短乳杆菌GDMCC 1.288：北京生物保藏中心。

果胶酶（500 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）：诺维信有限公司；MRS肉汤、MRS培养基（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：天津登科化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚（均为分析纯）：天津科密欧试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JYL-C022E榨汁搅拌机：九阳股份有限公司；UV-752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；ME-204E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器有限公司；RHB数字折光仪：上海奋业光电仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌发酵剂的筛选

1.3.1.1 生长曲线测定

采用比浊法，将5种乳酸菌活化液（菌液浓度>1.02×10CFU/mL），以3%接种量分别接种于MRS肉汤中，37 ℃、150 r/min 培养 24 h，于 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 取样，测定其在 600 nm 波长处吸光度值（OD值），以未接种MRS肉汤作空白对照，根据培养时间及OD值，绘制生长曲线，以明确不同乳酸菌生长速率。

1.3.1.2 耐酸性测定

将生长速率较高的3种乳酸菌活化液，以1%接种量分别接种于不同 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5）的 MRS中，于37℃、150 r/min培养36 h后取样，测定其在600 nm处的吸光度值，并以乳酸菌在未酸化MRS（pH6.0）中的生长情况作对比，考察3株乳酸菌耐酸特性。

1.3.2 工艺流程

黄精→挑选、称重→粉碎过1.25 mm筛→黄精与山楂以不同质量配比→浸泡→添加红糖、混合打浆→酶解→100℃灭菌15 min→接种发酵→过滤→成品。

1.3.3 操作要点

1.3.3.1 浸泡

黄精、山楂以不同质量配比后，于料液比1∶15（g/mL）、60℃下浸泡30 min。

1.3.3.2 打浆

浸泡后添加6.7%红糖，混合打浆5 min。

1.3.3.3 酶解

将打浆后的基质按质量分数添加4.5%复合酶（纤维素酶与果胶酶质量比为2∶1），于50℃下酶解60 min。

1.3.3.4 接种发酵

在接种发酵酵素过程中，最佳收集菌体时间为对数生长期末期，以此培养时间（20 h）收集菌体，按不同菌种体积比制备发酵菌液，进行接种发酵。由于黄酮类物质为黄精、山楂中重要的生物活性成分，并且感官品质对产品具有重要意义。因此，优化接种发酵工艺时，选取总黄酮含量及感官评分为综合评价指标。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 菌种体积比对复合酵素品质影响

采用黄精与山楂质量比4∶1制备发酵基质，以接种量4%、植物乳杆菌-类干酪乳杆菌体积比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4接种后，于 37℃静置发酵48 h，测定其总黄酮含量、乳酸菌活菌数并进行感官评价，确定最佳菌种体积比。

1.3.4.2 黄精与山楂质量比对复合酵素品质影响

固定其他条件，将黄精与山楂质量比设置为7∶1、4∶1、1∶1、1 ∶4、1 ∶7，考察黄精与山楂质量比对复合酵素品质的影响。

1.3.4.3 接种量对复合酵素品质影响

固定其他条件，将接种量设置为2%、4%、6%、8%、10%，考察接种量对复合酵素品质的影响。

1.3.4.4 发酵温度对复合酵素品质影响

固定其他条件，将发酵温度设置为25、29、33、37、

41℃，考察发酵温度对复合酵素品质的影响。

1.3.4.5 发酵时间对复合酵素品质影响

固定其他条件，将发酵时间设置为12、24、36、48、60 h，考察发酵时间对复合酵素品质的影响。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用四因素三水平Box-Behnken试验设计，选取黄精与山楂质量比（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为因素，以感官评分与总黄酮含量的综合评分（Y）为响应值，各因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.6 复合酵素感官评价

参照QB/T 5323—2018《植物酵素》中对于食用植物酵素的感官要求和张丽华等采用的9分制评分法，邀请具有发酵及感官品评相关专业背景的10名同学（5男5女），分别对复合酵素色泽、滋味、香气和组织形态4个方面进行评分，取其平均值，具体见表2。

表2 复合酵素感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of compound enzyme

1.3.7 基本理化指标测定

采用3，5-二硝基水杨酸分光光度法测定还原糖含量，标准曲线回归方程及相关系数分别为y=1.322 3x-0.058 8，R=0.999 7；参照 GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》测定总酸含量；利用酸度计测定pH值；利用折光仪在25℃下测定可溶性固形物，以°Brix 表示。

1.3.8 乳酸菌活菌数测定

参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定乳酸菌活菌数。

1.3.9 总黄酮含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力测定

采用NaNO-Al（NO）-NaOH比色法测定总黄酮含量，标准曲线回归方程及相关系数分别为y=0.457 4x-0.013 4，R=0.999 9。参照 GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》测定SOD活力。

1.4 数据处理分析

采用平均值±标准差的形式表示数据，利用Origin 2019绘制图形，Design-Expert 8.0.6.1进行响应面分析，IBM SPSS Statistics 26.0对数据进行单因素方差分析（P＜0.05）以及最小显著差数（least significant difference，LSD）、邓肯多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 发酵乳酸菌的筛选

2.1.1 不同乳酸菌生长性能分析

不同乳酸菌生长曲线见图1。

图1 不同乳酸菌生长曲线Fig.1 Growth curves of different lactic acid bacteria

由图1可知，植物乳杆菌ACCC 11095、植物乳杆菌AS 1.2437和类干酪乳杆菌CICC 21019生长速率较快，没有明显延滞期，很快进入对数生长期，其中植物乳杆菌ACCC 11095总体生长速率最快，并且进入稳定期后菌体数量最高，于18 h时达到对数生长期末期，其次为植物乳杆菌AS 1.2437、类干酪乳杆菌CICC 21019，两者分别于22、20 h达到对数生长期末期；干酪乳杆菌ATCC 334相对于其他菌株具有明显的延滞期、对数期及稳定期，但菌体浓度较低，于22 h进入稳定期；短乳杆菌GDMCC 1.288相较于其他菌株生长速率最慢，对数生长期最短且菌体浓度最低，于16 h进入稳定期。因此，植物乳杆菌ACCC 11095、植物乳杆菌AS 1.2437和类干酪乳杆菌CICC 21019生长性能较好，可进一步分析其耐酸特性。

2.1.2 不同乳酸菌耐酸特性分析

由于发酵基质初始pH值较低（4.0左右），且发酵过程中乳酸菌代谢产生乳酸等有机酸，使得基质在前期发酵中总酸含量迅速升高、pH值下降，抑制发酵菌株生长，从而影响产品最终品质。因此，发酵菌株不仅需要具有良好的生长性能，还要具备较好的耐酸特性，有助于基质正常发酵，保证产品品质。不同乳酸菌耐酸曲线见图2。

图2 不同乳酸菌耐酸特性Fig.2 The acid resistance of different lactic acid bacteria

由图2可知，3株乳酸菌在不同pH值条件下生长情况均受到不同程度影响，随着pH值的降低，抑制效果显著（P＜0.05）且逐渐增强。这与焦媛媛等在分离于水果发酵液等不同来源的6株乳酸菌进行耐酸特性研究时所发现的现象一致。在pH值由4.5降至3.0过程中，植物乳杆菌ACCC 11095生长趋势近似直线下降，抑制作用最为显著，而类干酪乳杆菌CICC 21019相较于其他两株菌抑制作用最弱，耐酸特性最好，其次为植物乳杆菌AS 1.2437，并且在pH值低于4.0时，植物乳杆菌AS 1.2437和类干酪乳杆菌CICC 21019的菌株生物量高于植物乳杆菌ACCC 11095。因此，综合考虑菌株耐酸特性及生长量等发酵潜力，选择具有较好生长速率及耐酸性的植物乳杆菌AS 1.2437和类干酪乳杆菌CICC 21019作为发酵菌株。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 菌种体积比对复合酵素发酵品质的影响

不同乳酸菌在发酵代谢特性、功能特性及生长性能等方面存在差异性，在利用乳酸菌发酵生产过程中，采用多种乳酸菌混合发酵，相较于单一乳酸菌发酵可有效减轻发酵产生的不良风味，并且不同乳酸菌之间存在着协同发酵作用，因此，采用多种乳酸菌共同发酵对酵素品质的提升具有重要意义。菌种体积比对复合酵素品质的影响见表3。

表3 菌种体积比对复合酵素品质的影响Table 3 Effect of strain volume ratio on the quality of compound enzyme

由表3可知，当采用植物乳杆菌AS 1.2437与类干酪乳杆菌CICC 21019体积比在4∶1～2∶1之间发酵复合酵素时，所得复合酵素总黄酮含量差异不显著。而后，当菌种体积比在1∶1～1∶4时，复合酵素总黄酮含量显著（P＜0.05）低于4∶1～2∶1。感官评分与乳酸菌活菌数在菌种体积比为2∶1时达到最大值，并与其他菌种体积比相比具有显著差异（P＜0.05）。因此，选择植物乳杆菌AS 1.2437与类干酪乳杆菌CICC 21019体积比为2∶1作为最佳菌种体积比进行后续优化试验。

2.2.2 黄精与山楂质量比对复合酵素发酵品质的影响

黄精与山楂质量比对复合酵素品质的影响见图3。

图3 黄精与山楂质量比对复合酵素品质的影响Fig.3 Effect of Polygonatum sibiricum and hawthorn mass ratio on the quality of compound enzyme

由图3可知，复合酵素总黄酮含量随黄精占比的减小（7∶1～1∶7）而逐渐增加，而感官评分则呈先升高后下降的趋势，于4∶1时达到最大值；由于黄精与山楂质量比在1∶1～1∶7之间，总黄酮含量并无显著差异，因此，选择黄精与山楂质量比 7∶1、4∶1、1∶1作为进一步优化工艺参数。

2.2.3 接种量对复合酵素发酵品质的影响

接种量对复合酵素品质的影响见图4。

图4 接种量对复合酵素品质的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on the quality of compound enzyme

由图4可知，复合酵素总黄酮含量和感官评分随着乳酸菌接种量的增大，均呈先升高后下降的趋势，这主要是由于接种量低时发酵时间长，容易污染杂菌，影响产品风味；而当接种量过高时，发酵速度较快，不仅使产品过酸同时因乳酸菌正常代谢消耗的营养成分增多，导致发酵产物减少。在接种量为4%时，感官评分达到最大值且与其他接种量具有显著差异（P＜0.05），而在接种量6%时，总黄酮含量达到最大值，且与接种量4%之间没有显著差异，因此，选择接种量2%、4%、6%进行后续优化。

2.2.4 发酵温度对复合酵素发酵品质的影响

发酵温度对复合酵素品质的影响见图5。

图5 发酵温度对复合酵素品质的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of compound enzyme

由图5可知，当发酵温度较低时，复合酵素发酵速度较慢，总黄酮含量及感官评分均最低，当温度为33℃时，感官评分和总黄酮含量达到最大值，随后逐渐降低，发酵温度对复合酵素感官评分的影响具有显著差异（P＜0.05），在发酵温度为33℃～37℃时复合酵素总黄酮含量变化不显著。研究表明，适宜温度范围对微生物代谢活动有着促进作用，各种生化反应活跃，有利于总黄酮等活性物质释放，而当发酵温度过高或过低时，均对菌体的正常生长代谢有一定抑制作用，造成发酵产品品质降低。因此，综合考虑选择发酵温度29、33、37℃进行后续优化。

2.2.5 发酵时间对复合酵素发酵品质的影响

发酵时间对复合酵素品质的影响见图6。

图6 发酵时间对复合酵素品质的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the quality of compound enzyme

由图6可知，复合酵素总黄酮含量与感官评分随着发酵时间的延长，均呈先升高后下降的趋势。当发酵时间过短时，发酵不充分，导致复合酵素原料风味较重，总体感官评分较低；随着发酵时间延长，乳酸菌代谢促进了黄酮类物质释放，总黄酮含量逐渐增加，但随着发酵时间继续延长，发酵基质中的黄酮类物质可能因部分氧化等原因而呈现下降趋势。当发酵时间为48h时，复合酵素感官评分与总黄酮含量均达到最大值。因此，选择发酵时间36、48、60 h为响应面优化参数。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 优化结果和方差分析

由单因素试验结果可知，感官评分相较于总黄酮含量对复合酵素品质贡献大，故采用多指标加权综合评分法设置Box-Behnken试验响应值，将总黄酮含量和感官评分的权重系数分别设定为40%和60%，综合评分（Y）=（总黄酮含量/复合酵素最高总黄酮含量）×40%+（感官评分/复合酵素最高感官评分）×60%，以优化黄精山楂复合酵素最佳发酵工艺参数，所得结果见表 4。试验 3、6、17、25、26 为 5 个零点试验，以估计试验误差，其余24个为析因试验。

将表4的试验数据进行多元回归拟合，得到Y综合评分与各因素之间的二次多元回归方程Y=0.93+0.049A-0.018B+0.016C+0.023D+0.022AB+0.010AC+0.015AD-0.005BC-0.002 5BD-0.007 5CD-0.091A-0.065B-0.034C-0.042D。将试验数据进行方差分析，其结果见表5。

表4 Box-Behnken试验设计与结果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

表5 响应面回归模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression model

由表 5可知，模型的 F 值为 22.690，P＜0.000 1，该模型极显著，失拟项F值为1.860，P值为0.288 5＞0.05，说明该模型失拟项不显著，并且模型的相关系数R值为0.957 8，表明模型与试验数据拟合情况良好，模型调整系数R为0.915 6，表明91.56%的响应值变化可通过该模型进行解释，可用于复合酵素发酵条件参数的理论预测。回归模型方差分析的显著性检验，可表明因素对响应值的影响；F值的大小，可反映各因素对复合酵素发酵工艺的重要程度。因此，通过对回归方程方差分析可知，一次项A、B、D 影响极显著（P＜0.01），C 影响显著（P＜0.05），交互项 AB 影响显著（P＜0.05），二次项 A、B、C、D影响极显著（P＜0.01），C影响显著（P＜0.05），说明各因素对复合酵素品质的影响不是简单的线性关系；通过对F值大小的比较，各因素对复合酵素发酵工艺影响的排序为黄精与山楂质量比（A）＞发酵时间（D）＞接种量（B）＞发酵温度（C）。

2.3.2 交互作用分析

等高线的形状可直观反映出各因素之间交互作用的显著性大小，即当等高线为椭圆形时，说明因素之间交互作用显著，当等高线为圆形时，说明交互作用不显著。黄精与山楂质量比和接种量交互作用对黄精山楂复合酵素综合评分影响的响应面和等高线图见图7。

图7 AB交互作用对总黄酮含量和感官评分的综合评分影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the influence of the interaction of AB on the comprehensive score of total flavonoids content and sensory evaluation

由图7可知，黄精与山楂质量比和接种量之间的交互作用对响应值的影响具有显著性（P＜0.05），这与表5中的结果一致。

2.3.3 最优条件的验证与确定

对数据及回归方程进一步分析计算，预测复合酵素最佳发酵工艺参数为黄精与山楂质量比4.89∶1、接种量3.79%、发酵温度34.01℃、发酵时间51.70 h，此条件下，复合酵素综合评分达0.95。考虑实际操作过程，将工艺参数修正为黄精与山楂质量比5∶1、接种量4%、发酵温度34℃、发酵时间52 h，在此条件下，进行3次验证试验，所得结果为0.94±0.03，是预测值的98.95%，表明该模型对黄精山楂复合酵素发酵工艺参数的分析预测具有良好效果。

2.4 黄精山楂复合酵素发酵前后品质变化分析

在酵素生产中，监测其发酵过程中感官品质、基本理化指标及功能性成分的变化，如pH值、总酸含量、还原糖含量、乳酸菌活菌数、SOD活力及总黄酮含量等，对于反映微生物发酵代谢能力、酵素品质以及发酵终点的判定等具有重要意义。采用优化的最佳发酵工艺制备黄精山楂复合酵素，对其发酵前后各项指标进行测定，以反映其品质的变化，结果见表6。

表6 复合酵素发酵前后品质的变化Table 6 Quality changes of compound enzyme before and after fermentation

由表6可知，在整个发酵过程中起关键作用的乳酸菌，通过其发酵代谢作用将基质中的糖类等物质进行转化，生成乳酸、苹果酸等有机酸释放于酵素之中，使得发酵结束时pH值、还原糖含量显著降低（P＜0.05），总酸含量显著升高（P＜0.05）。同时，产生的适宜糖酸比，赋予酵素产品柔和清爽的口感，与发酵前相比感官评分显著升高（P＜0.05）。研究发现，在发酵过程中基质糖酸比的动态变化与发酵基质、微生物种类、接种量及发酵时间等因素相关。发酵结束时，与初始发酵基质相比SOD活力及总黄酮含量显著增加（P＜0.05），其中SOD活力提高到2倍左右，乳酸菌活菌数也达到了3.42×10CFU/mL。研究表明发酵过程中形成的酸性环境，不仅对酵素风味产生了积极影响，而且对代谢积累的酚类化合物、SOD等活性物质也起到保护作用，并且发酵的乳酸菌大多为益生菌，其与活性物质的共同摄入，可以促进人体的健康。随着发酵的结束，酵素产品品质逐渐成熟，各项基本理化指标均满足QB/T 5323—2018《植物酵素》中的规定。

3 结论

通过分析植物乳杆菌ACCC 11095、植物乳杆菌AS 1.2437、类干酪乳杆菌CICC 21019、干酪乳杆菌ATCC 334和短乳杆菌GDMCC 1.288这5种乳酸菌的生长性能和耐酸特性，表明植物乳杆菌AS 1.2437和类干酪乳杆菌CICC 21019具有良好的发酵性能，可用于发酵黄精山楂复合酵素，采用单因素试验，以总黄酮含量、感官评分和活菌数为指标，得出两者体积比为2∶1时，复合酵素品质较佳。

在植物乳杆菌AS 1.2437与类干酪乳杆菌CICC 21019体积比为2∶1条件下，采用响应面优化试验设计，所得复合酵素发酵最佳工艺条件为黄精与山楂质量比5∶1、接种量4%、发酵温度34℃、发酵时间52 h，综合评分达到0.94，是预测值的98.95%；与黄精山楂复合浆相比，复合酵素通过发酵，pH值、可溶性固形物及还原糖含量显著降低（P＜0.05），感官评分、总酸含量、总黄酮含量及SOD活力显著升高（P＜0.05），乳酸菌活菌数达到了3.42×10CFU/mL。本试验为制备一种兼具良好风味及营养保健功能的新型黄精山楂复合酵素产品提供了参考。

加工编辑：姚骏