吴玉婷，谢超，周卓颖，李远慧，朱亚猛，史恬恬，王益男

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2.浙江驰力科技股份有限公司，浙江 舟山 316000）

鮸鱼属鲈形目石首鱼科，通体银灰色，常被称作米鱼。这种鱼类主要生活在温暖的水域，是底层洄游性鱼类。舟山东海中鮸鱼分布较多捕获量巨大，资源丰富。研究发现，鮸鱼有食补效果，具有补血、消炎、润肺等作用。鮸鱼肉是一种高蛋白低脂的肉类，且含有20种以上的不饱和脂肪酸，其中，棕榈油酸、丁酸、油酸含量较高。除此之外，鮸鱼肉中含有几种对人体有益的微量元素，其中K、Mg、Ca含量较多。因此鮸鱼具有极高的营养价值，既适合减脂健身的人群，还有益于缺铁性贫血和肝脏有炎症的人群。现阶段对鮸鱼多采用冷藏、冰块保鲜的简单处理，鱼肉品质判断的一个重要指标是生物胺的产生状况，目前关于鮸鱼中生物胺的研究较少。

生物胺由氨基酸脱羧而成，一般分为脂肪族、芳香族和杂环类胺，也可分为单胺和多胺类。常见的组胺和色胺属于单胺类物质，而尸胺和腐胺为多胺类物质。过量生物胺的摄入会使人中毒，情况较轻的产生头痛、呕吐等，情况严重的可能引起神经毒性。所以，对鱼类贮运过程中生物胺的形成及含量进行研究是有必要的。

该研究以舟山鮸鱼作为试验材料，探究25℃和4℃条件下鮸鱼品质及生物胺的变化，包括pH值、菌落总数（total bacterial count，TVC）、滴水损失率、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和几种常见生物胺含量变化趋势以及生物胺在鱼肉中的分布规律，以期为鮸鱼等水产品中生物胺形成机理的深入研究及如何控制生物胺从而延长鮸鱼保藏期提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鮸鱼：舟山市普陀昌津水产有限公司。

丙酮、氧化镁（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；盐酸标准溶液（分析纯）：以达科技（泉州）有限公司；硼酸（分析纯）：吉安市豪迈精细化工实业有限公司；氯化钠（分析纯）：上海博微生物科技有限公司；腐胺、尸胺、酪胺、组胺、丹黄酰氯（均为色谱纯）：美国sigma公司；正己烷、乙醚、正丁醇、氯仿、谷氨酸钠、三氯乙酸、氢氧化钠（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、丙酮（均为色谱纯）：美国Fisher Chomical公司。

从鮸鱼背部切取5 cm×3 cm×2 cm的长方块肉，将所有的方块肉平均分成对照组和试验组。对照组：75%酒精涂抹表面来减少鱼表面细菌；试验组：不做特殊处理。鱼块按照在鱼身的位置分为3个部分，最外层标记为外；中间层记为中；最里层则记为内。在指标测定试验中，选取同一区域的鱼肉，大小同上述，一组在4℃贮藏12 d，另一组在25℃中贮藏24 h。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-2030）：日本岛津公司；高速均质器（FSH-2A）：上海帅登仪器有限公司；针头微孔滤膜过滤器（0.22 μm）：上海佩欧生物科技有限公司；pH计（PHS-3E）；上海仪电科学仪器股份有限公司；超净工作台（SW-CJ-IFD型）：广东省医疗器械厂；色谱柱（SB-C18，250 mm×4.6 mm，孔径 100 Å，粒径 5 μm）：安捷伦仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

参考郭慧等、韩笑的丹黄酰氯衍生法处理样品。取5.00 g不同部位鱼肉泥，加入15 mL10%三氯乙酸溶液，充分振荡，5 000 r/min离心10 min，取上清液用三氯乙酸稀释至50 mL。取10 mL上述所得滤液，加入氯化钠至饱和，再加入5 mL正己烷，振荡5 min，静置。取下层溶液用NaOH将pH值调至12.0，吸取5 mL溶液后加入同体积正丁醇、氯仿溶液，取上层溶液滴加0.2mL 1mol/L的HCl，加入2mL 0.1mol/L HCl溶液。然后加入1mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液、1 mL饱和NaHCO溶液和0.1 mL 2 mol/LNaOH溶液，60℃水浴0.5 h后加入0.2 mL 50 g/L谷氨酸钠溶液，继续60℃水浴15 min，用氮气除去丙酮，再加入0.5 g氯化钠、1 mL水和3 mL乙醚。取下层溶液加入1 mL乙腈，最后用0.22 μm微孔滤膜针头滤器，注于进样瓶。生物胺标准溶液测定方法同上。

1.3.2 pH值的测定

取3 g绞碎均匀的鱼肉，加入30 mL蒸馏水，均质后过滤，pH计直接测定滤液pH值。

1.3.3 滴水损失率的测定

取35.0 g鱼肉，记为第一次鱼肉质量。将鱼肉置于膨胀的保鲜袋，用塑料线打结后悬空放在4℃冷藏环境下至24 h。取出后沥干测定第二次鱼肉质量。滴水损失率计算公式如下。

式中：w为滴水损失率，%；m为第一次测定鱼肉质量，g；m为第二次测定鱼肉质量，g。

1.3.4 菌落总数的测定

菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准菌落总数测定》中的方法测定。

1.3.5 挥发性盐基氮含量的测定

挥发性盐基氮含量参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中方法，使用自动凯氏定氮仪测定。

1.3.6 生物胺含量的测定

鱼类水产品中得到的生物胺多种多样，属尸胺、腐胺、组胺、酪胺较为普遍，这几种生物胺含量能够有效体现鱼肉新鲜程度且易检测，所以试验测定上述4种生物胺含量变化来判断鱼肉在贮藏期间生物胺产生情况。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

生物胺含量计算公式如下。

式中：X为被测样品中生物胺的含量，mg/kg；c为进样液中生物胺的含量，mg/L；n为稀释倍数；V为被测样品溶液体积，mL；m为样品总质量，g。

1.4 数据分析

利用Excel 2010与OriginPro 9.1整合各数据。

2 结果与讨论

2.1 鮸鱼肉pH值变化

25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉pH值变化见图1。

图1 25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉pH值变化Fig.1 pH changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由图1可知，鱼肉初始pH值为6.64，在25℃贮藏条件下，鱼肉pH值整体呈上升趋势，先平缓上升再快速上升，然后又出现了平缓的变化最终达到7.43；在4℃贮藏条件下，鱼肉的pH值同样呈上升趋势，在贮藏12 d时达7.50。水产品在贮藏过程中会发生一些生化反应。新鲜鮸鱼平均pH值在7.10，在死亡后会经历僵直、自溶、腐败3个阶段，期间会发生各种生化反应，所以鱼肉pH值会不断发生变化。在僵直阶段，反应物腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、磷酸肌酸通过生化反应得到的生成物为磷酸，糖酵解得到生成物为乳酸，这些生成物均会使鱼肉酸性增加。在鱼体自溶阶段，在内源性蛋白酶水解蛋白质氨基酸等含氮化合物和外源微生物共同作用下，鱼体会产生胺类等碱性物质，使鱼肉碱性增强。故在鮸鱼死后鱼肉的pH值应呈现先下降后上升的变化趋势，而试验中pH值没有下降阶段，表明鱼肉在测定pH值时已过僵直期，除此之外，25℃下的鱼肉可能是因为前期有酸性物质的生成减缓了pH值上升的速度。从pH值变化来看，两个温度贮藏过程中鱼肉均经历了自溶到腐败的过程，其中4℃冷藏可能通过降低微生物活性和酶活来减缓该过程。

2.2 鮸鱼肉滴水损失变化

导致鱼肉滴水损失变化的原因多种多样，如环境酸碱度和酶水解等作用。随着贮藏时间的延长，蛋白质、脂质在自身酶的作用和微生物的共同作用下发生水解反应，使得鱼肉组织结构松散，肌间蛋白截留水分能力下降，自由水含量升高，导致鱼肉汁液流失，加速鱼肉变质。25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉滴水损失变化见图2。

图2 25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉滴水损失变化Fig.2 Changes in water content of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由图2可知，在贮藏初期，两个温度贮藏条件下酶和微生物共同作用导致鱼肉肌肉持水性下降，使得鮸鱼鱼肉滴水损失率产生较大变化。25℃贮藏24 h后鮸鱼肉滴水损失达到4.83%，而4℃下的鱼肉贮藏12 d后滴水损失率达到4.69%。这说明4℃贮藏能有效延缓鱼肉组织结构松散，从而延缓鱼肉汁液流失。

2.3 鮸鱼肉菌落总数变化

鱼肉中微生物含量可以直观表明鱼肉新鲜程度。25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉TVC变化见图3。

图3 25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉TVC变化Fig.3 TVC changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃ and 4℃

如图3所示，在25℃和4℃贮藏条件下鮸鱼肉的初始 TVC 分别为 4.57 lg（CFU/g）和 4.49 lg（CFU/g），属于品质状态较佳的新鲜鱼肉，整个试验周期中，两者TVC整体均呈现上升趋势，25℃下的鱼肉TVC于贮藏终点达到 7.03lg（CFU/g），而 4℃下的则为 7.11lg（CFU/g）。微生物的生长和繁殖会分解鱼肉中的蛋白质，生成氨基酸等小分子物质，同时使得蛋白组织结构松散，试验过程中pH值、滴水损失率和TVC均呈现不断上升的趋势验证了这一理论。这说明4℃贮藏能有效延缓鱼肉中微生物的生长繁殖，延缓微生物对鱼肉的分解利用，从而延缓鱼肉品质劣变。

2.4 鮸鱼肉TVB-N变化

贮藏过程中，细菌不断代谢增殖，利用含氮化合物产生大量硫化物和三甲胺，产生的这些物质为腐败气味的主要来源。25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉TVB-N变化见图4。

图4 25℃和4℃贮藏的鮸鱼肉TVB-N变化Fig.4 Changes in TVB-N of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由图4可知，两个温度贮藏期间TVB-N初始分别为10.13mg/100g和10.24mg/100g。新鲜鱼的挥发性盐基氮一般在30 mg/100 g内，而试验对象初始值明显小于该值，表明鱼处于非常新鲜的范围。在试验贮藏期末，25℃条件下贮藏24h的TVB-N上升至36.53mg/100g，超过了新鲜鱼的TVB-N范围，而4℃条件下在贮藏9 d时才超过了30 mg/100 g，达到31.74 mg/100 g。从两者对比结果来看，低温环境通过抑制酶活抑制了微生物生长速度，从而很大程度上降低了TVB-N上升速率。

2.5 生物胺标准样品回归方程

生物胺回归方程以及适用区域见表2。

表2 标准品线性回归方程及适用区域Table 2 Linear regression equation and scope of use

2.6 鮸鱼肉中生物胺含量变化

影响水产品生物胺形成量的因素有很多，包括水产品种类、微生物种类和贮藏环境条件，所以各类水产品在不同温度条件下贮藏会产生的生物胺不一。25℃和4℃下鮸鱼肉生物胺含量的变化分别见图5和图6。

图5 25℃下鮸鱼肉生物胺含量的变化Fig.5 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 25℃

图6 4℃下鮸鱼肉生物胺含量的变化Fig.6 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 4℃

由图5可知，在25℃贮藏条件下，4种生物胺均呈现逐渐上升的趋势，整体趋势一致，但各增长速率有所不同，尸胺产生速率最快，而腐胺和组胺的产生速率相差不多，酪胺的生成速率最慢。在25℃贮藏条件下，4种生物胺在0～6 h时含量几乎为0，12 h后4种生物胺含量明显增加且出现不同程度的上升，其中增长最快的尸胺含量在24 h时达到了35.71 mg/kg，腐胺和组胺最终分别达到了22.54 mg/kg和21.48 mg/kg。酪胺含量最终仅有9.09 mg/kg。

由图6可知，在4℃条件下，0～3 d内4种生物胺含量少且未出现明显差别。与25℃贮藏相比，组胺大幅度上升，在12 d时达到了41.78 mg/kg，腐胺和尸胺含量的增长速率相差不多，酪胺仍增长最慢，0～12 d中未超过10 mg/kg，最终达到9.01 mg/kg。鱼肉表面微生物生长繁殖过程中利用氨基酸脱羧酶分解鱼肉中组氨酸、酪氨酸等氨基酸来产生生物胺，使得鱼肉表面生物胺含量大幅上升，随着贮藏时间的延长，中间层和内层鱼肉中的氨基酸也会被脱羧生成生物胺。而不同种类的细菌生长繁殖能力和所含的脱羧酶种类不同，因此各类生物胺产生的多少与快慢均有所区别。从图5和图6的趋势来看，4℃低温抑制了微生物生长，使生物胺的产生速率下降。与pH值、TVC值、TVBN和水分含量相结合分析，鱼肉在贮藏初期为较新鲜鱼肉，与生物胺含量所表明结果一致，高水分为微生物提供了合适的生长环境，因此TVC持续上升，含氮化合物产生碱性物质的生化反应随之增加，所以挥发性盐基氮含量和pH值也会随之上升。综上所述，鮸鱼肉中生物胺主要源于鱼肉表面微生物作用。

2.7 鮸鱼肉中生物胺分布情况

25℃贮藏条件下鮸鱼各部分生物胺含量见图7。

图7 25℃贮藏条件下鮸鱼各部分生物胺含量Fig.7 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 25℃

由图7可知，鱼肉从外到内，两组的生物胺含量均呈现逐渐降低趋势。这说明生物胺主要产生于外层，且主要原因并非内源酶作用。除此之外，试验组生物胺三层肌肉生物胺含量都明显大于对照组。25℃贮藏条件下，试验组生物胺含量从外到内依次为90.45、32.20、7.78 mg/kg，而对照组的生物胺含量分别为12.87、7.44、5.01 mg/kg。

4℃贮藏条件下鮸鱼各部位生物胺含量见图8。

图8 4℃贮藏条件下鮸鱼各部位生物胺含量Fig.8 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 4℃

由图8可知，4℃贮藏条件下，试验组生物胺含量从外到内依次为 101.59、35.32、18.39 mg/kg，而对照组的生物胺含量分别为26.39、8.10、2.00 mg/kg。对照组经过75%酒精擦拭处理，而试验组是在无特殊处理情况下测定。

25℃和4℃贮藏条件下的生物胺含量及分布均说明酒精抑制了鱼肉表明微生物的生长繁殖，因此可以得出，鱼肉中生物胺主要来源于鱼表面微生物的生长代谢。杨珊珊等也认为大多数的生物胺是由外源微生物中的氨基酸脱羧酶催化氨基酸等物质发生脱羧等一系列反应而产生的，少数生物胺由内源性的脱羧酶催化产生。

3 结论

研究表明在25℃和4℃贮藏条件下，鮸鱼肉pH值、滴水损失率、菌落总数、TVB-N和生物胺含量均呈现不断上升的趋势。鮸鱼肉的pH值均呈现逐渐上升的趋势，25℃下贮藏24 h上升至7.43，而4℃冷藏条件下贮藏12 d pH值达到7.50；25℃条件下贮藏终点TVB-N上升至36.53 mg/100 g，超过新鲜鱼的TVB-N范围，而4℃条件下在贮藏9d时才超过了30 mg/100 g，达到31.74 mg/100 g。不同温度下贮藏末期鮸鱼肉外层生物胺含量均显著高于其他部位，结合酒精擦拭表面试验表明生物胺的产生绝大部分来自于外源微生物的作用。以上研究结果为水产品中的生物胺产生机制的深入研究和如何控制生物胺延长鮸鱼保藏期奠定了一定的基础。