韩姣姣,张家慧,李爱香,苏庆娅,王威

河南大学淮河医院 麻醉科,河南 开封475000

七氟醚是一种常用吸入麻醉药,广泛用于手术室麻醉、牙科诊所麻醉和无痛人流、核磁共振检查镇静等[1-2]。在临床麻醉实施过程中,不可避免地导致七氟醚泄露于周围环境。国外有学者关于麻醉废气对手术室工作人员身体各系统影响进行了研究,结果表明:长期暴露于麻醉废气环境的女性患肝肾疾病、肿瘤、自发性流产等风险明显增加,男性患肝脏疾病及其后代先天性畸形的风险增加[3]。然而,长期低浓度七氟醚暴露是否会对免疫系统造成影响尚无明确定论。本研究构造长期低浓度七氟醚暴露小鼠模型,检测其T淋巴细胞亚群变化及小鼠淋巴细胞IL-17A、IFN-γ的表达,探讨长期低浓度暴露七氟醚对小鼠T淋巴细胞亚群及功能的影响。在本研究七氟醚暴露浓度的选择上,我们进行了预实验,观察检测到人类在环境中所嗅到的七氟醚浓度约为0.2%(v/v)。由于无法完全模拟手术室中七氟醚暴露环境(例如进行相关麻醉诱导操作时,七氟醚泄露浓度高于此浓度),本实验选择了0.2%(v/v)左右的浓度,即0.1%(v/v)和0.3%(v/v)的七氟醚暴露浓度。

1 材料与方法

1.1 模型制作

1.1.1 实验动物与分组

无特定病原菌级(SPF)KM 小鼠30只(购自北京维通利和动物有限公司),雌雄各15只,8周龄,体质量(20±2)g。小鼠饲养环境通风清洁,温度23～25℃,湿度45%～55%,明暗周期12 h/12 h,自由进食水。将KM 小鼠随机分为空气暴露组(C组)、0.1%(v/v)七氟醚暴露组(S1组)、0.3%(v/v)七氟醚暴露组(S2)组,每组10只,雌雄各5只。本实验研究通过我院医学伦理委员会批准,七氟醚购自河北一品制药有限公司(产品批号:C038200801)。

1.1.2 模型制作

实验中麻醉暴露处理装置为72 cm×53 cm×44 cm 的特制密闭透明容器。S1组、S2组每天暴露于相应浓度的七氟醚1 h,1周暴露5 d,连续暴露18周;C组暴露于空气。

1.1.3 标本采集

实验干预结束后,活体于小鼠左侧颈内动脉取动脉血1 mL。

1.1.4 试剂与仪器

小鼠荧光单抗CD3+、CD4+、CD8+、IL-17A、IFN-γ,购自美国BD 公司。实验常用的蒸馏水以及红细胞裂解液等,由河南大学基础医学实验室提供。BD 流式细胞仪,购自美国BD 公司。

1.2 检测指标

1.2.1 外周血淋巴细胞亚群检测

1)单细胞悬液制备。取150μL全血于流式管中,400g离心5 min,弃血浆,加入10倍体积红细胞裂解液,避光裂红2 min;300g离心10 min,弃红色上清,留沉淀;加入PBS重悬,洗涤沉淀1～2次后加入抗体进行染色。

2)外周血淋巴细胞膜表面标志检测。将CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 表面抗体按照一定的稀释比例加入至细胞悬液中,4 ℃避光孵育1 h;染色后的细胞上机进行分析,检测[CD3+]、[CD4+]、[CD8+]及[CD4+]/[CD8+]。

1.2.2 IFN-γ、IL-17A 检测

1)单细胞悬液制备。取300μL全血于流式管中,400g离心5 min,弃血浆,加入10倍体积红细胞裂解液,避光裂红2 min;300g离心10 min,弃红色上清,留沉淀;加入PBS重悬,洗涤沉淀1～2次;加入CD4-FITC和抑制剂,于4℃孵育1 h,500g离心5 min,弃去上清液,加入PBS洗涤1～2次;于每管加入100μL 固定透化液,4 ℃孵育20 min,用1×buffer洗涤2次后加入相应抗体进行染色。

2)外周血淋巴细胞膜表面标志检测。将IFNγ、IL-17A 表面抗体按照一定的稀释比例加入至细胞悬液中,4 ℃避光孵育1 h;染色后的细胞上机进行分析,检测[IFN-γ]、[IL-17A]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 外周血淋巴细胞亚群的比较

与C 组相比,S1 组和S2 组的[CD3+]、[CD4+]、[CD8+]及[CD4+]/[CD8+]的差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

表1 三组小鼠外周血淋巴细胞亚群比较

2.2 淋巴细胞亚群功能的影响

与C组和S1 组比较,S2 组的[IFN-γ]显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);三组的[IL-17A]相比较,差异不具有统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 三组小鼠细胞因子含量比较

3 讨论

机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞及免疫分子共同组成,具有免疫监视、防御、调控的作用,是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。淋巴细胞在机体免疫系统当中起着十分重要的作用,淋巴细胞主要根据其功能特征和表面标志可分为CD4+T和CD8+T 两个亚群。CD4+T 细胞主要分化产生三种效应细胞——Th1、Th2、Th17,它们分别通过分泌不同的细胞因子产生不同的免疫效应。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子,介导局部炎症反应和细胞免疫过程;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6等细胞因子,介导体液免疫反应过程;Th17细胞主要分泌IL-17A 细胞因子。研究[4]发现,Th17及其分泌的IL-17与自身免疫性疾病中炎症病理机制密切相关。

国外研究[5]表明,将体外T 淋巴细胞暴露于1.5 mmol/L的七氟醚环境24 h 可直接诱导其凋亡。2005年,Loop等[6]亦发现挥发性麻醉剂七氟醚、异氟醚均诱导人类T 淋巴细胞凋亡,其凋亡机制与七氟醚破坏线粒体膜电位造成细胞色素C 向胞质释放增加,激活caspase3,从而诱导凋亡,且其凋亡与暴露浓度和暴露时间呈正相关。本研究建造长期低浓度暴露七氟醚小鼠模型,研究低浓度七氟醚暴露对小鼠免疫系统影响,结果显示:长期低浓度七氟醚暴露不会导致小鼠T 淋巴细胞亚群及其分泌细胞因子功能下降。这一结果与上述实验结果不一致,其原因可能有二:①文献中研究方法均为体外实验,而本研究为活体小鼠体内实验。体外实验细胞无免疫调节机制,而小鼠体内的免疫调节机制可能会调节七氟醚暴露引起的免疫损害,外周免疫器官产生淋巴细胞,淋巴细胞不停再生,使七氟醚暴露对机体的损害降低。②七氟醚诱导T 淋巴细胞凋亡呈时间、剂量依赖性。该实验的七氟醚暴露浓度比体外实验引起免疫损害时的浓度低,不足以对体内淋巴细胞产生影响。本实验中,S2组小鼠的[IFN-γ]显著升高,其主要由Th1细胞、NK 细胞产生,是一种低分子量的糖蛋白,可以促进抗原呈递,提高NK 细胞和巨噬细胞溶酶体的活性,是细胞因子的重要组成之一,参与人体炎性和免疫反应[7]。这一结果可能与Th1细胞应激性分泌IFN-γ增多有关。因实验经费问题,本研究未检测其他细胞因子的分泌。

七氟醚大部分以气体从肺内原形排出,麻醉可控性高,广泛应用于临床麻醉。但是在使用吸入麻醉气体过程中不可避免地会从患者口腔、麻醉呼吸回路和麻醉机泄漏到手术室空气中,对患儿进行吸入诱导时,患儿不可避免地烦躁,挣脱面罩使七氟醚大量泄漏;PACU 病人烦躁呛管时从肺中呼出大量七氟醚气体,这些七氟醚气体相当一部分被位于患者头侧的麻醉医生吸入,使长期在手术室工作的人员尤其是麻醉医生长期暴露于微量麻醉废气的工作环境中。1977年美国职业安全局(OSHA)提出了关于麻醉废气的相关规定,对手术室中暴露麻醉药的浓度做出了限制性规定:任何工作人员暴露于卤化物麻醉药物的废气浓度不得超过2 cm3/m3,持续时间不超过1 h。然而,我国目前相关文献所调查医院手术室麻醉废气浓度均高于OSHA 标准。沈有君、高瑞君、于淼等[8-10]分别对深圳市、重庆市共499个手术间的七氟醚浓度进行检测,发现超出一半数量的手术室七氟醚的浓度超过限制标准2 cm3/m3。

国内外研究已证实七氟醚暴露对生殖系统、肝肾功能均有不同程度损害,而对免疫系统的影响尚无明确定论。本实验构造长期低浓度七氟醚暴露小鼠模型,结果证实对小鼠免疫系统并无影响。但本实验具有局限性,其暴露时长及浓度无法完全模拟手术室工作人员所处环境,七氟醚暴露对人体免疫系统的影响仍需要临床实验研究。在日常工作中,手术室工作人员仍应注意防护,减少七氟醚的泄露,避免职业暴露,加强自身保护。