王计虎，王政，范文勇，郑佳，陈伟强，许加军

山东第一医科大学附属省立医院神经外科，济南 250021

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，起源于神经胶质细胞或前体细胞，包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤或少突星形细胞瘤［1］。胶质瘤具有侵袭性强、易复发、预后差等特点。按照胶质瘤恶性程度分级，WHO把胶质瘤分为I～IV级。I、II级属于低级别胶质瘤（LGG），III、IV级属于高级别胶质瘤（HGG），胶质瘤的恶性级别越高预后越差。胶质瘤的常规治疗包括手术切除、化疗和放射治疗，由于肿瘤的异质性、侵袭性和血脑屏障的存在，治疗效果较差，高级别胶质瘤患者的生存期一般不足两年［2］。因此，探索胶质瘤潜在的生物标志物和治疗靶点具有重要意义。研究［3］发现，在肺癌中，纤维连接蛋白1（FN1）可以通过激活FAK信号来促进肺癌细胞的迁移。FN1先前被证明可以激活特定的基质金属蛋白酶（MMPs），促进乳腺癌的侵袭和转移［4］。在黑色素瘤中，FN1基因表达的上调通过降低Bax/Bcl2而抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖［5］。FN1基因在宫颈癌中有明显表达，miR-432抑制FN1基因的表达可抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭［6］。由此可见，FN1基因是一种体内广泛表达的癌基因。然而，FN1基因在胶质瘤中作用的研究尚少见报道。随着基因测序技术的迅速发展，癌症基因组图谱计划（TCGA）、肿瘤免疫评估数据库（TIMER）等数据库为胶质瘤生物学研究提供了可能。本研究利用生信分析技术，观察了FN1基因在胶质瘤组织中的表达变化，并探讨了其意义。

1 资料与方法

1.1 数据获取与预处理从TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库下载胶质瘤（LGG 278例，HGG 411例）FN1基因相关测序及临床数据。使用R软件3.6.3对TCGA GBMLGG（胶质瘤）项目中level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据进行统计分析与可视化，将FPKM（Fregments per Kilobase per Million）格式的RNAseq数据进行log2转化，数据过滤时剔除临床信息不完整的数据。此外，从GTEx数据库中获取正常脑组织数据（1 157例份）作为对照。

1.2 胶质瘤组织FN1基因与患者临床病理特征的关系分析及诊断效能评估通过R软件中的“ggplot2”软件包对TCGA数据库中的胶质瘤和GTEx数据库中的正常脑组织的FN1基因表达数据进行分析，并绘制基因差异表达图。将TCGA数据库中胶质瘤患者的临床病理特征数据导入到R软件中，利用“ggplot2”软件包进行Kruskal或Dunn’s检验，分析FN1基因表达与胶质瘤患者临床病理特征的相关性。

基于TCGA数据库内胶质瘤标本中FN1基因表达数据与患者临床病理特征的信息，用R软件中的“Survival”和“Survminer”软件包绘制不同FN1基因表达水平（以基因表达中位数为分界分为高表达与低表达）的生存曲线以及在不同WHO级别胶质瘤中的FN1基因的生存曲线。然后将GTEx数据库中的正常脑组织的FN1基因表达数据导入R软件，用“pROC”和“ggplot2”软件包绘制FN1基因和胶质瘤的受试者工作特征曲线（ROC）。

1.3 FN1基因与胶质瘤免疫细胞浸润相关性TCGA数据库胶质瘤的测序数据中提取免疫细胞相关项数据，采用R语言GSVA包ssGSEA算法分析FN1基因与24种不同亚型的免疫细胞浸润的相关性，并做可视化分析。将6种常见免疫细胞，如B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞与FN1基因在TIMER2.0数据库中进行联合分析，得出FN1基因与6种免疫细胞免疫浸润的相关性。

1.4 FN1基因表达与胶质瘤细胞功能状态的相关性分析在cancerSEA（调查细胞功能状态的数据库，其内包含多种癌症及多种细胞功能状态数据）的Search功能区，输入基因名称FN1，选择胶质瘤进行基因与癌症相关性分析。与输入基因有显著相关性的细胞功能状态被筛选出来，自动绘制散点图。

1.5 FN1基因的生物学功能分析利用R语言“clusterProfiler”和“ggplot2”软件包对FN1基因进行GO功能注释和KEGG通路富集。在R语言相关分析包中调整富集分析参数设置后，以P＜0.1且Q＜0.2为显著富集。

使用STRING在线数据库进行FN1检索，并下载检索后原始数据，利用Cytoscape进行数据分析并进行可视化处理，构建FN1的蛋白互作网络，找出FN1在体内的分子信号通路及FN1的互作蛋白。

2 结果

2.1 FN1基因在胶质瘤和正常脑组织中的表达比较，与患者临床病理特征的相关性，对胶质瘤的诊断效能TCGA数据库及GTEx数据库联合分析结果显示，FN1基因在正常脑组织中表达量中位数为5.010，在胶质瘤中为7.234，与正常脑组织相比，胶质瘤组织中FN1基因表达明显上调（P＜0.01）。

WHO II、III及IV级胶质瘤中FN1基因表达量中位数分别为3.612、4.193、6.135，各级别之间两两比较，P均＜0.01。胶质瘤组织中FN1基因表达量低的样本IDH突变率（88%）高于FN1基因表达量高的样本（40%）。FN1基因表达量低的样本1p19q共缺失概率（37%）高于FN1基因表达量高的样本（12%）。年龄＞60岁的患者FN1基因高表达比例（77%）比≤60岁的患者（43%）高（P＜0.01）。胶质母细胞瘤患者FN1基因表达量中位数（6.343）高于其他病理类型［星形细胞瘤（4.211），少突星型细胞瘤（3.987），少突胶质细胞瘤（3.741）］，差异有统计学意义（P均＜0.01）。

FN1基因表达与胶质瘤患者总生存期（OS）、疾病特异性生存率（DSS）、无进展生存期（PFI）呈负相关（P均＜0.001）；在WHOⅢ级胶质瘤中，FN1基因表达与患者总生存期呈负相关（P＜0.05），在WHOⅡ/Ⅳ级胶质瘤中，FN1基因表达与患者总生存期无相关性（P分别为0.277、0.207）；FN1基因的ROC分析 结 果 表 明，ROC下 面 积 为0.926，（95%CI=0.914～0.937）。

2.2 FN1基因表达与胶质瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性TIMER数据库结果显示，FN1基因表达与活化树突状细胞、细胞毒性细胞、嗜酸性粒细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK CD56dim细胞、自然杀伤细胞、T cells、辅助性T细胞、Th1细胞、Th17细胞、Th2细胞呈正相关关系（Rs分别为0.490、0.337、0.533、0.434、0.668、0.590、0.398、0.242、0.399、0.329、0.245、0.209、0.611，P均＜0.001）。与NK CD56bright cells、浆细胞样树突状细胞、滤泡辅助性T细胞、Tgd细胞、调节性T细胞五种免疫细胞呈负相关关系（Rs分别为-0.329、-0.401、-0.183、-0.146、-0.195，P均＜0.01）。

TIMER数据库分析提示，在LGG中，FN1基因表达与B Cell、CD8+T Cell、CD4+T Cell、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞呈正相关（偏相关分析系数r分别为0.274、0.311、0.336、0.417、0.381、0.398，P均＜0.001），与肿瘤纯度无关（P＞0.05）；在GBM中，FN1基因表达与肿瘤纯度、CD8+T细胞呈负相关（r分别为-0.319、-0.109，P均＜0.05），与树突状细胞呈正相关（r=0.408，P＜0.001），与B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞无关（P＞0.05）。

2.3 FN1基因表达与胶质瘤细胞功能状态的相关性FN1基因的表达与肿瘤血管内皮细胞再生、肿瘤细胞分化呈正相关（r分别为0.58、0.47，P均＜0.01）；与肿瘤细胞DNA损伤、细胞周期呈负相关（r分别为=-0.52、-0.45，P均＜0.01）。

2.4 FN1基因的生物学功能FN1基因有关的生物过程（BP）共有351条，细胞组分（CC）共有28条，分子功能（MF）共有94条；KEGG分子信号通路29条。以P＜0.001为筛选条件，其中生物过程是补体激活、循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答、体液免疫反应；细胞组分是免疫球蛋白复合物、循环免疫球蛋白复合物、质膜外侧；分子功能是抗原结合、免疫球蛋白受体结合、细胞外基质结构成分。分子信号通路主要与细胞因子—细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用、细胞外基质—受体相互作用有关。

FN1蛋白互作网路提示FN1与ITGB1、ITGB3、ITGA3、ITGA4、ATGA5、ITGAV、CD44和THBS1蛋白关系密切，见图1。

图1 胶质瘤中FN1的蛋白互作网络

3 讨论

FN1基因位于2号染色体上［7］，编码由2 477个氨基酸组成的细胞外基质糖蛋白—纤维连接蛋白1［8］。FN1在多种细胞类型中广泛表达，同时存在于血浆和细胞表面，介导细胞和细胞外基质之间的广泛相互作用，在细胞黏附、迁移、生长和分化中发挥重要作用。FN1同时参与伤口愈合、胚胎发育、防御机制和肿瘤发生等生命过程［9］。

2021 年相关文献［10］报道在胶质瘤中，通过分析GEPIA（基因表达谱交互分析）数据库，验证了FN1基因在胶质瘤中高表达并且与胶质瘤分级相关，且是胶质瘤的不良预后因素。本研究利用TCGA和GTEx数据库联合分析发现，FN1基因在胶质瘤中表达高于正常脑组织，并且与肿瘤WHO分级、IDH分型、1p19q状态、患者年龄及胶质瘤的组织病理学分型有关。K-M生存分析表明FN1基因表达与胶质瘤患者的总生存期、无进展生存期呈负相关。因此认为FN1基因在胶质瘤中高表达并且与预后相关，可以作为临床胶质瘤的诊断和预后判断指标应用于临床。

目前，肿瘤的免疫微环境受到越来越多的关注，尤其是浸润性免疫细胞。文献报道，胶质瘤相关巨噬细胞/单核细胞作为肿瘤支持细胞，可以从血液循环侵袭到胶质瘤，已被证明可促进胶质瘤的生长和侵袭［11］。调节性T细胞（Treg）通过依赖CTLA-4和CD28的反馈环进行自我调节，可促进肿瘤免疫耐受，达到免疫逃避［12］。肿瘤浸润性T细胞中CD4+和CD8+的百分比与肿瘤分级和预后相关。最近一项针对ErbB2的CAR NK细胞靶向治疗胶质瘤的可行性研究已经完成，为NK细胞治疗胶质瘤的临床应用奠定了基础［13］。这些研究提示肿瘤浸润性免疫细胞对胶质瘤的进展起着重要作用。有研究［14］利用CiberSort在线分析，得出在甲状腺癌中，FN1表达与免疫渗透的巨噬细胞、CD4+T细胞及辅助性T细胞等密切相关。本研究利用TCGA及TIMER数据库数据分析，发现FN1的表达与树突状细胞、细胞毒性细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及自然杀伤细胞等密切相关。因此认为，FN1表达可能通过促进胶质瘤免疫微环境中的免疫细胞浸润来介导胶质瘤的发生与发展。目前，免疫细胞靶向治疗已逐渐成为恶性肿瘤的常规治疗手段，联合FN1的靶向治疗可以成为一个新的方向。

据报道，FN1基因表达与血管内皮生长因子（VEGF）有关，VEGF在肿瘤微环境中高度表达，并诱导肿瘤血管生成，在不同类型癌症中发挥重要作用［6］。已有研究［15］表明，纤维连接蛋白的缺失显著降低了胶质母细胞瘤的生长和血管生成。本研究结果显示，FN1基因表达与肿瘤血管内皮细胞再生呈显著正相关，因此认为，FN1基因可能通过促进肿瘤微环境中的血管增生，从而促进胶质瘤生长。通过抑制FN1基因的表达影响肿瘤血管增生，从而抑制胶质瘤的生长也许胶质瘤治疗的另一个研究方向。研究［16］发现，FN1基因在胶质瘤的细胞外基质中高水平表达。本研究中KEGG和GO富集分析提示，FN1主要定位在肿瘤微环境细胞外基质中，并且与细胞因子建立多种信号通路。胶质瘤微环境中丰富的细胞外基质非常重要，是维持胶质瘤形态、细胞分化和增殖的关键，以上信息表明FN1基因通过在细胞外基质中高水平表达，来丰富细胞外基质，从而维持肿瘤的分化和增殖。由此可见，FN1在胶质瘤组织中的定位是细胞外基质中，明确FN1的作用场所，进而更深地理解该蛋白的分子作用机制。

蛋白互作网络提示FN1与ITGB1、ITGB3及CD44等蛋白密切相关。ITG相关蛋白属于整合素家族，它们与细胞外基质和细胞骨架相互作用，与细胞增殖、癌变和免疫反应等有关［17］。有研究［18］发现，FN1与肿瘤细胞上的整合素受体结合后，通过激活Src激酶来促进Survivin的表达和免疫细胞的浸润，促进胶质瘤的进展。CD44蛋白是一种非激酶跨膜糖蛋白，可以激活细胞信号通路，诱导细胞增殖，在癌症发生和发展中发挥作用［19］。本研究利用生信分析预测的FN1的互作蛋白包括ITG相关蛋白、CD44、SDC4等。说明FN1可能与ITG相关蛋白之间相互作用从而参与胶质瘤的发生发展。目前FN1与CD44或SDC4之间的相关研究仍未见报道，有待进一步研究。

综上所述，FN1基因在胶质瘤中高表达，并且是胶质瘤患者不良预后的影响因素。在促进胶质瘤发生发展中，FN1基因和肿瘤微环境免疫细胞浸润、肿瘤血管增生和与多种蛋白建立信号通路有关。本研究为纯生物信息学分析，有待体内外实验进一步验证。