俞方毅，宁波，叶劲超，梁一鸣，陈家祥，许智蕾

（广州市红十字会医院 神经外科，广东 广州 510220）

脑胶质瘤是最常见的成人中枢神经系统原发性恶性肿瘤，目前研究［1］表明大量miRNA与脑胶质瘤发生发展密切相关，而miRNA－221在多种肿瘤的发生中起关键作用，被认为是肿瘤相关的关键miRNA之一。本研究通过检测miRNA－221在脑胶质瘤中的表达水平及通过沉默miRNA－221，探讨其对脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响，为脑胶质瘤的诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年至2019年术后病理证实为脑胶质瘤和瘤周组织35例手术标本。其中男性19例，女性16例，年龄（54.13±5.78）岁。

1.2 qRT-PC检测Trizol法提取组织细胞RNA。miRNA－221基因引物上游下游分别为：5＇－AAAAAAAAAAGCCCGCAGC TA CATTGTCTGCTG－3＇，5＇－AAAAAAAAAAG T GCAGGGTCCGAGGT－3＇。内参GAPDH引物上游下游分别为：5＇－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3＇；5＇－CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA－3＇。检测脑胶质瘤组织和瘤旁组织的miRNA－221表达水平。

1.3 细胞克隆形成、凋亡、周期检测构建miRNA－221沉默的脑胶质瘤U251细胞，miRNA－221干扰效率采用qRT－PCR检测，两组细胞分别采用培养板以实验组设3个复孔为基础，接种细胞经培养、换液、洗涤、固定后进行克隆计数、流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，采用Student＇s t检验。所有分析均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR NA-221在脑胶质瘤组织和瘤旁组织的表达qRT－PCR检测35例脑胶质瘤组织及相应瘤旁组织显示，miR NA－221在脑胶质瘤组织的表达水平高于瘤周组织（P＜0.05）。见图1。

图1 脑胶质瘤组织和瘤旁组织中的miRNA-221表达水平

2.2 miRNA-221的干扰效率白色荧光和荧光显微镜下U251－miRNA－221组和U251－miRNA－221沉默组的慢病毒感染效率均高于80%，且两组细胞生长良好，未见明显细胞毒性作用，提示慢病毒感染效果良好。qRT－PCR检测结果显示，U251－miRNA－221沉默组中miRNA－221表达水平仅为U251－miRNA－221组的29.13%，明显低于U251－miRNA－221组（P＜0.05），提示miRNA－221沉默的脑胶质瘤U251细胞系构建成功，可用于下一步细胞功能学实验。

2.3 miRNA-221沉默对脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响细胞克隆形成实验显示，慢病毒感染后，U251－miRNA－221沉默组的脑胶质瘤U251细胞形成的克隆数量明显少于U251－miRNA－221组（P＜0.05），提示沉默miRNA－221可抑制脑胶质瘤U251细胞增殖。见图2。

图2 细胞克隆形成实验结果

2.4 miRNA-221沉默对脑胶质瘤U251细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默组的细胞凋亡率高于U251－miRNA－221组（P＜0.05），提示miRNA－221沉默可促进脑胶质瘤U251细胞凋亡。见图3。

图3 细胞凋亡检测结果

2.5 miRNA-221沉默对脑胶质瘤U251细胞周期的影响流式细胞检测显示，miRNA－221沉默后，两组细胞的G1、S和G2／M期细胞比例比较无明显差异（P＞0.05），提示miRNA－221沉默对脑胶质瘤U251细胞周期无明显影响。

3 讨论

脑胶质瘤为颅内常见肿瘤，发病机制不明，与等位基因杂合缺失、遗传性变异、细胞信号通路异常、功能性紊乱及DNA损伤修复干细胞等相关［2］。本研究以慢病毒介导的小干扰RNA沉默人脑胶质瘤U251细胞miRNA－221的表达，观察miRNA－221对脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响。本研究采用qRT－PC技术分别检测miRNA－221在脑胶质瘤组织和瘤旁组织的表达，结果显示miRNA－221在人脑胶质瘤组织中的表达水平高于瘤旁组织；荧光显微镜下U251细胞的荧光染色情况显示，两组慢病毒感染效率均高于80%，提示慢病毒感染效果良好；qRT－PCR检测结果也显示，miRNA－221沉默后miRNA－221表达水平明显下降，提示miRNA－221沉默的脑胶质瘤U251细胞系构建成功。本研究采用细胞克隆形成实验检测U251细胞增殖情况，结果显示miR－221沉默可抑制脑胶质瘤U251细胞的增殖。范崇桂等［3］在脑胶质瘤细胞中采用抑制剂沉默miRNA－221表达，结果显示脑胶质瘤细胞的增殖能力显著下降，提示miRNA－221确实可在体外调控脑胶质瘤细胞生长，其机制可能与靶向激活蛋白APAF1相关。本研究流式细胞仪检测显示，miRNA－221沉默后两组脑胶质瘤U251细胞G1、S和G2／M期细胞比例未见明显差异，提示miRNA－221沉默对细胞周期无明显影响。而张春智等［4］的研究表明，miRNA－221／222抑制剂同时敲低miRNA－221和miRNA－222的表达可诱导脑胶质瘤U251细胞G1期阻滞。本研究流式细胞仪检测结果显示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默组的细胞凋亡率高于U251－miRNA－221组，提示miRNA－221沉默可促进脑胶质瘤U251细胞系凋亡。范崇桂等［3］的体外实验也得到了同样结果，并通过生物信息学技术进一步确定了凋亡蛋白酶活化因子1是miRNA－221的靶基因。miRNA的一些异常表达，如miRNA－221等也被证实对癌基因及抑癌基因有调控作用［5］。基于本实验结果可推测，miRNA－221沉默可诱导脑胶质瘤U251细胞凋亡，进而抑制细胞增殖。有研究［6］显示在脊髓胶质母细胞瘤中亦有相同结果，但单纯沉默miRNA－221是否也可抑制U251细胞侵袭尚需进一步研究。

综上所述，miRNA－221基因在人脑胶质瘤组织呈高表达，而慢病毒介导小干扰RNA沉默miRNA－221可明显抑制脑胶质瘤U251细胞系的生长增殖并促进其凋亡，提示miRNA－221是一个潜在的脑胶质瘤治疗靶点。